一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测用的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测用的试剂盒及检测方法。本发明专利技术通过设计一组MB

【技术实现步骤摘要】
一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测用的试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测用的试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是微孢子虫的一种，属于肠胞虫科，是一种单细胞的真核内寄生虫，广泛寄生于虾、甲壳类等动物。其感染途径较广，可通过污染的养殖水体和病虾进行水平传播，也可以通过受精卵和虾苗进行垂直传播。EHP感染的对虾初期没有明显症状，但随着病程的发展体色、胃和肠均表现出明显异常，体色发白、肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩，个别虾体还会出现白便症状。由于该病在早期难以发现，往往要养殖30～45d以上才会表现出生长缓慢，不长个的现象，因此极易造成饲料空耗，给养殖户带来巨大的经济损失。对于该病的防治方法，国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的EHP病原检测方法是减少虹彩病发生和危害的重要途径。
[0003]目前，对于对虾是否感染肠胞虫病毒的检验的黄金标准仍然是实时荧光定量PCR，然而该方法的执行需要昂贵的温控设备，且频繁的温度循环需要耗费大量的时间，很难适应当前快速、准确检测的需要。
[0004]环介导等温扩增技术(1oop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi于2000年开发的一种恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4
‑
6条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温条件(60
‑
65℃左右)下放置30
‑
60min，即可完成核酸扩增反应。作为一种简单、快速、成本低、特异性强的检测技术，已在食品安全、微生物检验、临床诊断等方面得到了广泛应用。
[0005]LAMP技术应用于临床的最大问题在于其多采用观测焦磷酸镁白色沉淀、HNB染料颜色、钙黄绿素荧光等方法判断阳性，但上述方法的阳性检测结果只能代表实验过程中发生了LAMP反应过程，而无法区分真正的由引物和对应目标DNA模板杂交而形成的阳性扩增结果和由于引物之间、引物与样本DNA之间误杂交发生误扩增所导致的假阳性结果，对临床检测造成了不便。
[0006]分子信标(molecular beacon，MB)是1996年Tyagi等专利技术的一种有茎环结构的荧光探针。当没有靶序列存在时，分子信标探针低温时自身闭合，荧光基团和淬灭基团在空间上相互靠近，荧光淬灭。而在有靶序列存在的情况下，分子信标与互补的靶序列形成稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团在空间上相互分离，从而发出荧光信号，在LAMP扩增的过程中，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与扩增的模板量成正比，因此通过对反应体系荧光值的观测，即可判断是否存在靶序列的扩增。该技术具有极高的特异性，而且与LAMP的结合避免了复杂昂贵的仪器、操作简便、灵敏度高，特别是适用于当前快速诊断的需求。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一目的在于提供一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测用的核酸序列组合，其中包括分子信标，该分子信标包含EHP SSU rDNA上的一段特异性序列，具有检测快速、灵敏度高且特异性高的优点，适用于虾肝肠胞虫隐性感染的早期监测。
[0008]本专利技术的第二目的在于提供一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测(MB
‑
LAMP)用的试剂盒，该试剂盒同样也具有高灵敏度、高特异性和高稳定性的特点，适用于虾肝肠胞虫感染初期无症状监测。
[0009]本专利技术的第三目的在于提供一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测方法，该方法能够快速高效地进行扩增，不仅操作简便，而且鉴定也更为简便。
[0010]一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测用的核酸序列组合，包括：一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP、一对环引物LF和LB，以及分子信标MB，序列分别为：
[0011]外引物F3：5
’‑
GATGCTTGGTGTGGGAGAA
‑3’
；
[0012]外引物B3：5
’‑
CCCCCCATCAATTTCCAACG
‑3’
；
[0013]内引物FIP：5
’‑
TCCTGGTAGTGTCCTTCCGTCATTTTTTTTCGGGCTCTGGGGATA
‑3’
；
[0014]内引物BIP：5
’‑
AACGCGGGAAAACTTACCAGGGTTTTGCACCACTCTTGTCTACCTC
‑3’
；
[0015]环引物LF：5
’‑
TCACCCTTGCGAGCGTAC
‑3’
；
[0016]环引物LB：5
’‑
TCAAGTCTATCGTAGATTGGAGACA
‑3’
；
[0017]分子信标MB：5
’‑
FAM
‑
GTACGCTTCACCCTTGCGAGCGTAC
‑
DABCYL
‑3’
，且分子信标MB的5
’
端和3
’
端分别标记了荧光基团和淬灭基团，5
’
端的6个外加碱基和3
’
端的6个碱基完全互补，形成茎环结构，3
’
端的19个碱基于环引物LF相同，互补于靶序列。
[0018]其中，分子信标MB上的荧光基团为FAM，淬灭基团为DABCYL。
[0019]本专利技术又提供了一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测用的试剂盒，包括所述的核酸序列组合。
[0020]所述的试剂盒，还包括阳性对照和阴性对照，阳性对照包含SEQ ID No.1所示序列的质粒，阴性对照为无核酸的超纯水。
[0021]本专利技术又提供了所述试剂盒在虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测中的应用。
[0022]本专利技术还提供了一种非疾病诊断为目的的虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测方法，使用所述的试剂盒，检测方法包括以下步骤：
[0023](1)提取待检测样品的DNA；
[0024](2)以步骤(1)提取的DNA为模板，使用所述核酸序列组合进行分子信标环介导等温扩增反应；
[0025](3)根据步骤(2)反应结果，出现扩增曲线的为阳性，否则为阴性。
[0026]其中，步骤(2)中分子信标环介导等温扩增反应体系为：10
×
ThermoPol反应缓冲液2.5μL，10mM dNTP 3.5μL，100mM MgSO4水溶液1.5μL，10μM FIP 0.8μL，10μM本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测用的核酸序列组合，其特征在于，包括：一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP、一对环引物LF和LB，以及分子信标MB，序列分别为：外引物F3：5
’‑
GATGCTTGGTGTGGGAGAA
‑3’
；外引物B3：5
’‑
CCCCCCATCAATTTCCAACG
‑3’
；内引物FIP：5
’‑
TCCTGGTAGTGTCCTTCCGTCATTTTTTTTCGGGCTCTGGGGATA
‑3’
；内引物BIP：5
’‑
AACGCGGGAAAACTTACCAGGGTTTTGCACCACTCTTGTCTACCTC
‑3’
；环引物LF：5
’‑
TCACCCTTGCGAGCGTAC
‑3’
；环引物LB：5
’‑
TCAAGTCTATCGTAGATTGGAGACA
‑3’
；分子信标MB：5
’‑
FAM
‑
GTACGCTTCACCCTTGCGAGCGTAC
‑
DABCYL
‑3’
，且分子信标MB的5
’
端和3
’
端分别标记了荧光基团和淬灭基团，5
’
端的6个外加碱基和3
’
端的6个碱基完全互补，形成茎环结构，3
’
端的19个碱基于环引物LF...

【专利技术属性】
技术研发人员：李元源，胡可顺，王丰，陈宇菱，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：