一种D-赖氨酸的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种D

【技术实现步骤摘要】
一种D
‑
赖氨酸的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种D
‑
赖氨酸的制备方法。

技术介绍

[0002]D
‑
赖氨酸为非蛋白质氨基酸，它具有有效的抗真菌性和抗菌性，是新药开发的重要药物中间体，在医药上具有重要的作用。D
‑
赖氨酸是合成促黄体生成素释放激素类似物的前体，也可以用于合成促性腺激素释放激素高活性类似物，口服和静脉给药均可降低肿瘤治疗中放射性肽的肾摄取，D
‑
赖氨酸比L
‑
赖氨酸更适合在癌症治疗中使用。
[0003]现有的D
‑
赖氨酸的制备方法主要采用化学法，但是化学法来制备D
‑
赖氨酸流程复杂，涉及到的中间产物的分离提取过程复杂，且成本高，不适合大规模的工业化生产。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是现有的制备D
‑
赖氨酸的方法复杂，成本高，不适合大规模工业化生产，目的在于提供一种D
‑
赖氨酸的制备方法，以解决以上问题。
[0005]本专利技术通过下述技术方案实现：
[0006]一种D
‑
赖氨酸的制备方法，包括以下步骤：
[0007]构建表达赖氨酸消旋酶的工程菌；
[0008]构建表达LysOx的工程菌BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx；
[0009]菌株培养得到高活性表达赖氨酸消旋酶的菌株以及BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx菌株；
[0010]提供一混合溶液，所述混合溶液包括L
‑
赖氨酸及其盐、L
‑
赖氨酸氧化酶和过氧化氢清除剂(CAT)；向所述混合溶液通入氧气或空气进行反应，得含6
‑
氨基
‑2‑
氧代己酸和D
‑
赖氨酸的混合液。
[0011]分离纯化。
[0012]可选地，所述表达赖氨酸消旋酶的工程菌的过程为：
[0013]将赖氨酸消旋酶Lyr的氨基酸序列(Gene ID：NZ_CP043870.1)进行密码子优化后，全基因合成该序列，两端设计酶切位点NdeI和XhoI，克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a
‑
lyr；将构建好的重组质粒pET28a
‑
lyr转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，得到表达赖氨酸消旋酶的菌株BL21(DE3)/pET28a
‑
lyr。
[0014]可选地，所述构建表达LysOx的工程菌BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx的过程为：
[0015]将LysOx的氨基酸序列(Gene ID:AB937978.1)进行密码子优化后，全基因合成该序列，两端分别设计酶切位点NcoI和BamHI，克隆到表达载体pRSF
‑
Duet上，得到重组质粒pRSF
‑
LysOx；将重组质粒pRSF
‑
LysOx导入E.coliBL21的感受态细胞中，得到表达LysOx的重组菌BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx。
[0016]可选地，将得到的BL21(DE3)/pET28a
‑
lyr菌株、BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx菌株分别在培养基中培养；
[0017]所述培养基为LB液体及固体培养基，培养条件为：37℃、200rpm，复苏培养1h转至
37℃恒温箱培养过夜。
[0018]酸的过程包括：
[0019]制备赖氨酸消旋酶全细胞；
[0020]向pH为7.0，0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中加入所述赖氨酸消旋酶全细胞、L
‑
赖氨酸，于37℃、200r/min振荡反应1～3h；12000rpm离心5min，去除赖氨酸消旋酶细胞；
[0021]向体系中补加重组菌BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx，调节pH至7.0～9.0，继续37℃震荡反应8
‑
12h，至HPLC检测L
‑
赖氨酸被消耗完，停止反应。
[0022]可选地，所述制备赖氨酸消旋酶全细胞的过程为：
[0023]将得到的BL21(DE3)/pET28a
‑
lyr菌株接种在含有卡那霉素抗性LB的摇管里，37℃200rpm条件下培养8h，转接到含有卡那霉素抗性的摇瓶里，震荡培养至OD600nm为0.3～0.6；
[0024]向上述摇瓶中加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，在20℃、200rpm条件下诱导培养至OD600nm为40～50；
[0025]将得到的菌液在4000g条件下离心10min，弃上清，并将收集的细胞用pH为7.0的PBS重悬，得到赖氨酸消旋酶全细胞；
[0026]所述发酵培养基成分为：酵母膏10～15g/L，蛋白胨10～15g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，磷酸氢二钾10～20g/L，甘油5～20g/L，硫酸镁0.1～1g/L，氯化铵0.5～2g/L，氯化钠1～10g/L，葡萄糖1～10g/L。
[0027]可选地，所述赖氨酸消旋酶全细胞与L
‑
赖氨酸在体系中的浓度比为10～30:100～133。
[0028]可选地，重组菌BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx在体系中的浓度为30～60g/L。
[0029]可选地，所述混合液为包含D
‑
赖氨酸和6
‑
氨基
‑2‑
氧代己酸的溶液；
[0030]所述分离纯化的过程为：
[0031]调整所述混合液的pH至3.5～4.5；
[0032]将混合液与阳离子交换树脂进行离子交换，洗脱，得D
‑
赖氨酸洗脱液；
[0033]浓缩所述D
‑
赖氨酸洗脱液，降温析晶，分离。
[0034]可选地，所述阳离子交换树脂中的固定相对D
‑
赖氨酸吸附，洗脱时使用的洗脱剂为氨水，洗脱浓度为2～6％。
[0035]本专利技术具有如下的优点和有益效果：
[0036]本专利技术采用酶利用多酶偶联催化，通过构建表达赖氨酸消旋酶的工程菌BL21(DE3)/pET28a
‑
lyr、表达对D
‑
赖氨酸具有专一性的LysOx的工程菌BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx进行赖氨酸消旋、拆分，然后进行全细胞催化，在催化反应结束后反应体系中只剩下D
‑
赖氨酸，L
‑
赖氨酸被全部转化为6
‑
氨基
‑2‑
氧代己酸，使得制备的D
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种D
‑
赖氨酸的制备方法，其特征在于，包括：构建表达赖氨酸消旋酶的工程菌；构建表达LysOx的工程菌BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx；菌株培养得到高活性表达赖氨酸消旋酶的菌株以及BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx菌株；以L
‑
赖氨酸为原料，全细胞催化转化生产D
‑
赖氨酸，得到混合液；分离纯化。2.根据权利要求1所述的一种D
‑
赖氨酸的制备方法，其特征在于，所述表达赖氨酸消旋酶的工程菌的过程为：将赖氨酸消旋酶Lyr的氨基酸序列(Gene ID：NZ_CP043870.1)进行密码子优化后，全基因合成该序列，两端设计酶切位点NdeI和XhoI，克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a
‑
lyr；将构建好的重组质粒pET28a
‑
lyr转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，得到表达赖氨酸消旋酶的菌株BL21(DE3)/pET28a
‑
lyr。3.根据权利要求1所述的一种D
‑
赖氨酸的制备方法，其特征在于，所述构建表达LysOx的工程菌BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx的过程为：将LysOx的氨基酸序列(Gene ID:AB937978.1)进行密码子优化后，全基因合成该序列，两端分别设计酶切位点NcoI和BamHI，克隆到表达载体pRSF
‑
Duet上，得到重组质粒pRSF
‑
LysOx；将重组质粒pRSF
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LysOx导入E.coliBL21的感受态细胞中，得到表达LysOx的重组菌BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx。4.根据权利要求2所述的一种D
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赖氨酸的制备方法，其特征在于，将得到的BL21(DE3)/pET28a
‑
lyr菌株、BL21(DE3)/pRSF
‑
LysOx菌株分别在培养基中培养；所述培养基为LB液体及固体培养基，培养条件为：37℃，200rpm，复苏培养1h转至37℃恒温箱培养过夜。5.根据权利要求1所述的一种D
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赖氨酸的制备方法，其特征在于，全细胞催化转化生产D
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赖氨酸的过程包括：制备赖氨酸消旋酶全细胞；向pH为7.0，0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中加入所述赖氨酸消旋酶全细胞10～30g/L、L
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赖氨酸133g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：李倩，唐德强，张瑞，刘鹏，曾帅，
申请(专利权)人：绵阳晟氏健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：