一种玉米赤霉烯酮降解酶及其编码基因、制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种玉米赤霉烯酮降解酶及其编码基因、制备方法与应用，该降解酶氨基酸序列包括：1)如SEQ ID NO.1所示的蛋白；2)氨基酸序列如SEQID NO.1所示蛋白的突变体。本申请提供的降解酶及其突变体蛋白具有在酸性环境下玉米赤霉烯酮降解酶的活性，本发明专利技术还构建了能够表达该降解酶的质粒和工程菌株，实现了该酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的异源表达。该酶可用于农业、饲料和食品等工业领域，降低因玉米赤霉烯酮污染对人畜健康造成的危害。赤霉烯酮污染对人畜健康造成的危害。赤霉烯酮污染对人畜健康造成的危害。

【技术实现步骤摘要】
一种玉米赤霉烯酮降解酶及其编码基因、制备方法与应用


[0001]本专利技术属于农业生物
，具体涉及一种具有降解玉米赤霉烯酮活性的蛋白、基于玉米赤霉烯酮降解酶改造的突变体、编码该蛋白的基因、插入该基因的重组载体、转化含有该基因的转化体、制备该玉米赤霉烯酮降解酶的方法和该玉米赤霉烯酮降解酶在农产品脱毒中的应用。

技术介绍

[0002]玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是又称F
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2毒素，是一种由镰刀菌产生的类雌激素性质的真菌毒素。ZEN及其还原产物具有促进动物生长作用，早前其结构类似物玉米赤霉醇被用作生长促进剂添加于饲料中，但随后其毒性为人所知，1988年欧盟宣布禁止将玉米赤霉醇作为生长促进剂。ZEN具有强烈的生殖毒性，能够与雌激素受体结合表现出雌激素活性，造成动物体内生殖激素紊乱，从而破坏动物生殖发育系统，动物中尤以猪对ZEN最敏感。应用物理、化学方法能够对玉米赤霉烯酮进行去毒，但是这些方法在脱毒的同时会引入许多不确定因素，也会吸附或者改变食品中的营养成分。生物降解法降解玉米赤霉烯酮的反应温和、绿色安全、特异性强，应用前景十分广阔。
[0003]近年来，全国各地区谷物及其加工制品检测的ZEN含量均有超标现象，这不仅造成宝贵的粮食资源的浪费，还对人畜健康造成了极大的威胁。目前，对于ZEN降解酶的研究主要集中于Clonostachys rosea来源的内酯水解酶ZHD101及其衍生物，这类降解酶可有效的将ZEN转化为无毒产物，且这一类酶的最适反应pH为8.0～10.0(表1)。<br/>[0004]表1不同微生物来源的ZEN内酯水解酶性质的比较
[0005][0006][0007]然而在饲料工业中，通常需要添加1％
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3％的柠檬酸或乳酸进行饲料酸化，以弥补家畜因缺乏胃酸而造成的消化不良，因此饲料的pH值一般为5.0左右。现有研究的ZEN降解
酶在实际应用中(酸性环境)存在酶活力低的问题。因此，提供一种在酸性环境实现高效降解玉米赤霉烯酮的新的酶资源已经成为本领域亟待解决的技术难题。

技术实现思路

[0008]针对上述问题，本专利技术提供了一种具有降解玉米赤霉烯酮活性的蛋白、基于玉米赤霉烯酮降解酶改造的突变体、编码该蛋白的基因、插入该基因的重组载体、转化含有该基因的转化体，该蛋白及其突变体在酸性环境中具有较高的酶活力，可以应用于降解农产品及饲料中的玉米赤霉烯酮。
[0009]具体而言，本申请是通过如下技术方案实现的：
[0010]首先，本申请提供了一种玉米赤霉烯酮降解酶，该玉米赤霉烯酮降解酶包括以下任一种蛋白：
[0011]1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；
[0012]2)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示蛋白的突变体，所述突变体蛋白具有降解玉米赤霉烯酮的活性；
[0013]所述突变体是指SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第51位(S51E)、第105位(Q105L)、第131位(L131M)、第157位(T157S)、第164位(H164P)、第168位(N168L)、第182位(Y182W)、第184位(A184G)、第215位(A215P)、第223位(D223E)、第234位(T234R)、第241位(A241T)、第257位(A257G)、第277位(E277S)、第286位(D286S)氨基酸中的至少一个发生突变获得的蛋白；所述突变是指相应位点的氨基酸被取代、缺失或添加一个或两个氨基酸。
[0014]优选的，上述突变体优选如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第182位、第184位和第257位氨基酸中的至少一种发生突变获得的蛋白；特别是Y182W和A184G的组合突变、Y182W和A257G的组合突变、A184G和A257G的组合突变、Y182W、A184G和A257G的组合突变中的任意一个，这些突变体提高降解酶在pH 5.0时的催化活性。
[0015]优选的，上述突变体蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.3
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SEQ ID NO.9氨基酸序列所示蛋白中的任一种。
[0016]其次，本申请还提供了上述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因，该编码基因的核苷酸序列包括以下任一种：
[0017]1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
[0018]2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列第50位至300位碱基经修饰、取代、缺失或添加一个或几个碱基获得的核苷酸序列。
[0019]第三，本申请提供了上述玉米赤霉烯酮降解酶的制备方法，具体步骤如下：
[0020](1)构建包含所述玉米赤霉烯酮降解酶基因的重组质粒，并将其转化至宿主细胞，得到转化体；
[0021]所述重组质粒包含如下核苷酸序列中的一种：a)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；B)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列第50位至300位碱基经修饰、取代、缺失或添加一个或几个碱基获得的核苷酸序列；
[0022](2)培养转化体，诱导玉米赤霉烯酮降解酶表达；
[0023](3)分离纯化获得玉米赤霉烯酮降解酶。
[0024]优选的，上述玉米赤霉烯酮降解酶的制备方法中，所述宿主细胞包括大肠杆菌、枯
草芽孢杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母中的至少一种。
[0025]上述制备方法中，构建重组质粒、制备转化体、表达、分离纯化技术均采用本领域常规方法，如专利CN110283804A、文献“嗜吡啶红球菌多氯联苯降解基因的克隆与表达，孙艳等，《中国环境科学》，2004”、“有机磷农药降解酶的基因克隆与重组表达，杜欣军等，《中国卫生检验杂志》，2009”、“不动杆菌3
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苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达，梁俊仕等，《生物技术进展》，2015”、“玉米赤霉烯酮降解酶基因zly
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6在枯草芽孢杆菌中的表达，符浩东等，《核农学报》，2022”中所公开的方法。
[0026]第四，本申请还提供了上述玉米赤霉烯酮降解酶在降解农产品和饲料中玉米赤霉烯酮的应用。
[0027]优选的，该玉米烯酮降解酶的应用方法是指，在受(玉米赤霉烯酮)污染的农产品或饲料中按照1％的添加量(m/m)加入上述玉米赤霉烯酮降解酶，优选同时加入10％(m/m)以上的纯水或者pH 5.0
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8.0的缓冲液，于室温下搅拌均匀后静置30min，以实现对农产品或饲料中玉米赤霉烯酮的降解。
[0028]本申请中，术语“农产品”包括提供家畜营养需要、且在合理饲喂下不发生有害现象的物质，如大米、高粱、花生、玉米、小麦以及各个地区土特产等。
[0029]第五，本申请还提供了一种重组质粒，所述重组质粒包含如下核苷酸序列中的任一种：a)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
[0030]b)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列第50位至300位碱基经修饰、取代、缺失或添加一个或几个碱基获得的核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玉米赤霉烯酮降解酶，其特征在于，该降解酶包括以下任一种：1）氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；2）氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示蛋白的突变体；所述突变体是指如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第51位、第105位、第131位、第157位、第164位、第168位、第182位、第184位、第215位、第223位、第234位、第241位、第257位、第277位、第286位氨基酸中的至少一个发生突变获得的蛋白。2.如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解酶，其特征在于，所述突变体是指如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第182位、第184位和第257位氨基酸中的至少一个发生突变获得的蛋白。3. 如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解酶，其特征在于，所述突变体包括氨基酸序列如SEQ ID NO.3
‑
SEQ ID NO.9所示蛋白中的至少一种。4.一种玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列包括以下任一种：1）如SEQ ID NO.2所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐剑宏，胡俊强，王刚，史建荣，刘馨，李仁远，谢里夫，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：