一株高产棘白菌素B的菌株及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株高产棘白菌素B的菌株，所述菌株为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)Gen

【技术实现步骤摘要】
一株高产棘白菌素B的菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物育种
，尤其涉及一种通过二甲基亚砜介导的核糖体工程筛选得到的棘白菌素B高产菌株，还涉及上述菌株的应用。

技术介绍

[0002]棘白菌素类药物是一种新型抗真菌药物，通过抑制β
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1,3
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葡聚糖合成酶活性来干扰真菌细胞壁的合成，哺乳动物细胞没有细胞壁，因此该类药物的毒副作用小，且安全性高，对念珠菌属、曲霉菌属及部分对唑类耐药的真菌类均有抗菌活性。现已获得批准上市的棘白菌素类药物包括卡泊芬净(2004年在美国上市)、米卡芬净(2005年在日本上市)和阿尼芬净(2006年在美国上市)，它们都具有相似的非核糖体六元环肽类母核结构，差异仅在于侧链基团、氨基酸连接顺序和后修饰基团的不同。其中卡泊芬净和米卡芬净已在国内上市，阿尼芬净由于产量低，市场售价高，临床中的应用推广受到了一定的影响，具有广阔的市场前景。
[0003]阿尼芬净的工业生产包括三个过程，首先是由Aspergillus nidulans发酵合成前体化合物棘白菌素B，然后再经过犹他游动放线菌发酵水解掉脂肪链，最后通过化学方法加上一个人工合成的侧链获得阿尼芬净。其中，Aspergillus nidulans发酵合成阿尼芬净前体棘白菌素B是工业生产的第一步，也是整个工艺的关键核心。高性能的发酵菌株是控制生产成本的关键因素，也是限制该行业准入的技术门槛。目前，国内外学者提升棘白菌素B发酵水平的研究主要着眼于诱变育种、发酵优化与调控和代谢工程。但是，进一步的系统分析发现核心途径可供理性改造的靶点有限，相较于理性改造，诱变育种的随机性特点在菌株综合发酵性能改良时更能发挥出优势，尤其是对于相对复杂的多细胞微生物，所以目前工业生产使用的绝大多数放线菌和丝状真菌菌株都是通过诱变育种获得的。有效微生物育种方法的缺乏使棘白菌素B产量的进一步大幅度提高受到限制，为了适应工业化生产要求，需要通过合适的遗传育种手段快速提高棘白菌素B生产菌株的发酵水平。本专利技术通过二甲基亚砜(DMSO)介导的核糖体工程技术、发酵优化和萃取处理优化后，获得了一株棘白菌素B高产菌株。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一株高产棘白菌素B的菌株，所述菌株为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)Gen
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9,所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.40074，保藏日期为2022年1月29日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010
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64807355。
[0005]另一方面，本专利技术还提供了一种菌剂，所述菌剂包括上述菌株。
[0006]在一个实施方式中，所述菌剂为液体制剂或固体制剂。
[0007]另一方面，本专利技术还提供了一种发酵上述菌株的方法，所述方法包括利用培养基对上述菌株进行发酵的步骤。
[0008]在一个实施方式中，上述发酵的温度为20℃
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40℃，优选，25℃；上述发酵的时间为2d
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20d，例如，10d
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15d。
[0009]在一个实施方式中，所述培养基的成分包括甘露醇，花生油，甘油，黄豆饼粉，蛋白胨，FeSO4·
7H2O，K2HPO4，MgSO4·
7H2O，MnSO4·
H2O，CuSO4·
5H2O，CaCl2。
[0010]另一方面，本专利技术还提供了上述菌株或菌剂在生产棘白菌素B中的应用。
[0011]另一方面，本专利技术还提供了一种制备棘白菌素B的方法，所述方法包括对上述菌株进行发酵的步骤。
[0012]进一步的，所述制备棘白菌素B的方法还包括分离/纯化所述棘白菌素B的步骤。
[0013]另一方面，本专利技术还提供了一种制备阿尼芬净的方法，所述方法包括如下步骤：
[0014](1)利用本专利技术所述的菌株制备棘白菌素B；
[0015](2)利用步骤(1)得到的棘白菌素B制备阿尼芬净。
[0016]在一个实施方式中，上述步骤(2)可通过以下方式实现：由棘白菌素B经过犹他游动放线菌发酵水解掉脂肪链，最后通过化学方法加上侧链获得阿尼芬净。
[0017]进一步的，上述制备阿尼芬净的方法还包括分离/纯化阿尼芬净的步骤。
[0018]本专利技术公开了一种应用DMSO介导的核糖体工程技术筛选棘白菌素B高产菌株的选育方法。具体包括筛选DMSO破坏细胞壁的合适浓度，通过DMSO的介导筛选有效的抗生素，在合适的庆大霉素抗性平板上获得了一株高产棘白菌素B的菌株Gen
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9，通过发酵优化和萃取处理优化，高产菌株比对照菌株提高了111.4％。本专利技术效果显著，可用于棘白菌素B优良菌株的筛选，改善现有的筛选方法，加快选育速度，提高发酵液的效价、发酵产量。
附图说明
[0019]此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0020]图1.最适DMSO浓度的确定。
[0021]图2.DMSO介导的有效抗生素的筛选。
[0022]图3.不同发酵菌株棘白菌素B产量，图中横线位置为野生型对照菌株的发酵产量。
[0023]图4.优化发酵条件后诱变菌株棘白菌素B产量，图中横线位置为野生型对照菌株的发酵产量。
[0024]图5.优化萃取处理条件后诱变菌株棘白菌素B产量，图中横线位置为野生型对照菌株的发酵产量。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0026]PDA固体培养基：39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品，产品目录号：633840)，余量为去离子水，115℃高压灭菌30min，待冷却至约60℃制备平板。
[0027]种子培养基：5～30g/L棉籽饼粉，5～20g/L葡萄糖，5～10g/L甘油，余量为去离子水，用NaOH调节至pH 5.0～7.0，121℃高压灭菌20min。
[0028]发酵培养基：60～150g/L甘露醇，15～50g/L花生油，5～20g/L甘油，5～20g/L黄豆饼粉，5～20g/L蛋白胨，0.01～0.07g/L FeSO4·
7H2O，5～10g/L K2HPO4，0.2～1g/L MgSO4·
7H2O，0.1～0.8g/L MnSO4·
H2O，0.3～0.8g/L CuSO4·
5H2O，0.1～0.5g/L CaCl2，余量为去离子水,自然pH，121℃高压灭菌20min。
[0029]实施例1.最适DMSO浓度的确定
[0030]以野生菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高产棘白菌素B的菌株，所述菌株为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)Gen
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9,所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.40074，保藏日期为2022年1月29日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010
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64807355。2.包含权利要求1所述菌株的菌剂。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体制剂或液体制剂。4.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂在生产棘白菌素B中的应用。5.一种发酵权利要求1所述菌株的方法，其特征在于，所述方法包括利用培养基对所述菌株进行发酵的步骤。6.一种制备棘白菌素B的方法，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪峰，刘永娟，黄雪年，王贝贝，周宇，谷猛，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：