一种重组人溶菌酶提取物及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种重组人溶菌酶提取物的制备方法、利用该制备方法得到的重组人溶菌酶提取物、以及该重组人溶菌酶提取物的用途。此外，本发明专利技术还提供了含有该重组人溶菌酶提取物的化妆品组合物以及化妆品。根据本发明专利技术制备方法得到的重组人溶菌酶提取物具有更强的抗菌抑菌、抗氧化、美白祛斑效果，且没有皮肤刺激性，适于作为化妆品的成分使用。适于作为化妆品的成分使用。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人溶菌酶提取物及其制备方法和用途


[0001]本专利技术属于化妆品
，具体涉及一种溶菌酶提取物及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]溶菌酶(lysozyme)，又称为胞壁质酶或N
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乙酰胞壁质聚糖水解酶，广泛存在于自然界，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N
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乙酰胞壁酸和N
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乙酰氨基葡萄糖之间的β
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1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复合体，使病毒失活。溶菌酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、乳汁等液体，以及微生物也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。其中根据其来源的不同，可以将其分为四类，分别是植物溶菌酶、动物溶菌酶、微生物溶菌酶以及蛋清溶菌酶。据研究，溶菌酶具有抗细菌、抗真菌、抗病毒作用，目前已应用于药学领域，在人体内非特异性免疫中发挥着重要作用，具有杀菌抗炎、促进组织修复以及增强免疫力等多种生物活性作用，以及作为一种安全、广谱的杀菌防腐剂应用于食品工程领域。
[0003]近年来，溶菌酶也逐渐应用于化妆品领域。例如中国专利申请CN202110173038.9提供了一种清爽型长效保湿美白化妆品，在该化妆品的制备方法中使用了相转变溶菌酶溶液，作为制备该化妆品过程中使用的改性材料，但是在最终的化妆品中并不含有直接含有溶菌酶。中国专利申请CN201810909401.7提供了一种用于化妆品的溶菌酶组合抑菌剂，由特定质量百分比的溶菌酶、乙基己基甘油、辛酰羟肟酸、以及戊二醇/己二醇酸组成。《中国已使用化妆品原料名称目录(2021版)》中也已经收录溶菌酶(No.05560)，表示其作为化妆品原料已得到认可。
[0004]人溶菌酶是一种低分子量的、能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。作为机体免疫防御机制的组成部分之一，溶菌酶能溶解细菌细胞壁而起到杀菌作用。在人体内，溶菌酶存在于中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞内；也存在于黏膜分泌液中，成为体表防御因素之一。溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人体无毒性。作为化妆品成分，使用人溶菌酶相对于其他类型的溶菌酶具有更加安全的特性。
[0005]在转基因水稻胚乳中表达重组人溶菌酶具有无病原菌污染、生产成本低、不受原料限制的特点，可为人类提供安全、廉价和充足的人溶菌酶，用于人类多种疾病的治疗。同时本转基因的终产品需经纯化后的蛋白质，不进入食物链，因而不会对人体产生毒性。现有技术中已有报导利用水稻生产人溶菌酶的技术，例如一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶。

技术实现思路

[0006]从作为化妆品原料的角度来说，需要一种刺激性小、抗菌作用更强且具有有益化妆品性质(例如可美白祛斑性质)的重组人溶菌酶产品及其制备方法。针对这一需求，专利技术
3.6mmol/L、APMSF 3mmol/L、PMSF 0.7mmol/L，调节pH至7.1，搅拌20分钟后放置6小时，然后再加入35％的饱和硫酸铵产生沉淀，4000转/分钟离心，留取上清液；
[0025](7)在上清液中加入724型树脂，按照每升上清液中加入0.3L树脂，静置20小时后舍弃液体，保留树脂，用蒸馏水冲洗并控干树脂；
[0026](8)用质量分数为15％的硫酸铵水溶液洗脱树脂，按照每升树脂中加入等体积的硫酸铵溶液，然后在每升洗脱液中加入30克的晶体硫酸铵，在3℃的温度下放置12小时，收集沉淀的溶菌酶粗品；
[0027](9)配置溶菌酶精制液：按照7g/L的浓度在正己烷中加入三辛基甲基氯化铵，搅拌均匀后按照80g/L的浓度加入大豆卵磷脂，调节pH至8.0后按照1g/L的浓度加入辛巴蓝F
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3GA以及按照0.05g/L的浓度加入NaCl，放置24小时后使用pH8.0的5mM磷酸缓冲液洗去多余的辛巴蓝F
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3GA，静置分层后保留有机层，并在有机层中按照35g/L的浓度加入吐温85，搅拌均匀备用；
[0028](10)精制溶菌酶：在每升步骤(9)制得的溶菌酶精制液中加入100g步骤(8)制得的溶菌酶粗品溶液，在25℃的水浴下保持15分钟，在5000转/分的速度下离心10分钟后保留沉淀，使用包含2M浓度的NaCl且pH为7.3的0.1M磷酸钠溶液冲洗3次，得到高纯度溶菌酶。
[0029]进一步地，本专利技术中所用的表达重组人溶菌酶提取物的农作物种子为水稻种子。
[0030]在本专利技术的一个实施方案中，提供了一种重组人溶菌酶提取物，其通过本专利技术所述的重组人溶菌酶提取物的制备方法制备。
[0031]在本专利技术的一个实施方案中，提供了一种化妆品组合物，其包含根据本专利技术所述的重组人溶菌酶提取物，或者包含通过本专利技术所述的重组人溶菌酶提取物的制备方法制备得到的重组人溶菌酶提取物。
[0032]本专利技术还提供了一种包含上述化妆品组合物的化妆品，所述化妆品为选自润肤乳、皮肤柔顺剂、爽肤水、收敛剂、润肤液、乳液、保湿润肤液、营养润肤液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华素、面膜、香皂、洗面奶、洁肤露、洁面霜、润肤露或身体乳中的任何一种。
[0033]本专利技术还提供了上述重组人溶菌酶提取物用于制备化妆品的用途，所述化妆品为选自润肤乳、皮肤柔顺剂、爽肤水、收敛剂、润肤液、乳液、保湿润肤液、营养润肤液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华素、面膜、香皂、洗面奶、洁肤露、洁面霜、润肤露或身体乳中的任何一种。
[0034]相对于现有技术而言，本专利技术的重组人溶菌酶提取物及包含该提取物具有更强的抗菌抑菌、抗氧化、美白祛斑效果，且源于植物成分，没有皮肤刺激性，安全性良好，适于作为化妆品的成分使用。
具体实施方式
[0035]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0036]本专利技术所用的表达人溶菌酶的转基因水稻可以为根据现有技术获得的任意种类或任何手段获得的表达人溶菌酶的转基因水稻，例如美国专利申请10/584,225中公开的转基因水稻，本专利技术的制备例1
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3中所用的转基因水稻为根据美国专利申请10/584,225说明
书实施例1(质粒的构建)和实施例2(转基因水稻植株的产生)记载的方法获得。
[0037]制备例1重组人溶菌酶提取物的制备
[0038]按照如下方法制备重组人溶菌酶提取物：
[0039](1)获取表达重组人溶菌酶提取物的农作物种子，该农作物种子为转基因水稻；
[0040](2)将步骤(1)中获取的所述农作物种子粉碎，加入pH 7的0.03mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，放置3小时后过滤，留取滤液备用；
[0041](3)将步骤(2)所得的滤液在零下30℃的温度条件下进行冻融本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人溶菌酶提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)获取表达重组人溶菌酶提取物的农作物种子；(2)将步骤(1)中获取的所述农作物种子粉碎，加入pH 7
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8的0.03
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0.08mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，放置3
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5小时后过滤，留取滤液备用；(3)将步骤(2)所得的滤液在零下30℃至零下20℃的温度条件下进行冻融循环3
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6次，每次间隔20分钟；(4)对经过步骤(3)处理的滤液在冰水浴的条件下进行超声波处理，超声波处理的条件为400
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1000W，时间为10
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30分钟；(5)对经过步骤(4)处理的滤液在0
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10℃下高速离心，离心速度为8000
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120000转/分，离心时间为20
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30分钟，取上清液；(6)在步骤(5)所得的上清液中加入氯化镁15mmol/L、EDTA 2mmol/L、AEBSF 3.6mmol/L、APMSF 3mmol/L、PMSF 0.7mmol/L，调节pH至7.0
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7.2，搅拌20分钟后放置5
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8小时，然后再加入35％的饱和硫酸铵产生沉淀，3000
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5000转/分钟离心，留取上清液；(7)在上清液中加入724型树脂，按照每升上清液中加入0.3L树脂，静置12
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24小时后舍弃液体，保留树脂，用蒸馏水冲洗并控干树脂；(8)用质量分数为15％的硫酸铵水溶液洗脱树脂，按照每升树脂中加入等体积的硫酸铵溶液，然后在每升洗脱液中加入30克的晶体硫酸铵，在0
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5℃的温度下放置12小时，收集沉淀的溶菌酶粗品；(9)配置溶菌酶精制液：按照5
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10g/L的浓度在正己烷中加入三辛基甲基氯化铵，搅拌均匀后按照70
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90g/L的浓度加入大豆卵磷脂，调节pH至8.0后按照1g/L的浓度加入辛巴蓝F
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3GA以及按照0.05g/L的浓度加入NaCl，放置24小时后使用pH8.0的5mM磷酸缓冲液洗去多余的辛巴蓝F
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3GA，静置分层后保留有机层，并在有机层中按照35g/L的浓度加入吐温85，搅拌均匀备用；(10)精制溶菌酶：在每升步骤(9)制得的溶菌酶精制液中加入100g步骤(8)制得的溶菌酶粗品溶液，在25℃的水浴下保持15分钟，在5000转/分的速度下离心10分钟后保留沉淀，使用包含2M浓度的NaCl且pH为7.3的0.1M磷酸钠溶液冲洗3次，得到高纯度溶菌酶。2.根据权利要求1所述的重组人溶菌酶提取物的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：(1)获取表达重组人溶菌酶提取物的农作物种子；(2)将步骤(1)中获取的所述农作物种子粉碎，加入pH 7.5的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，放置4小时后过滤，留取滤液备用；(3)将步骤(2)所得...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪哲，吴雅勤，
申请(专利权)人：广州恒雅生物化工有限公司，
类型：发明
国别省市：