形成磺酰胺与多肽的缀合物的方法技术

提供了一种形成磺酰胺与多肽的缀合物的方法，所述方法包括：a)提供活化磺酰胺，其中所述活化磺酰胺对应于式(I)；b)提供具有游离氨基基团的多肽的水溶液，其中所述水溶液任选地包含醇；c)使b)的所述水溶液与a)的所述活化磺酰胺接触；以及d)使所述活化磺酰胺与所述具有游离氨基基团的多肽反应，获得包含磺酰胺与多肽的缀合物的溶液，其中所述磺酰胺与所述多肽共价键合。还提供了相关的缀合物、方法、程序、胰岛素原等。胰岛素原等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】形成磺酰胺与多肽的缀合物的方法

技术介绍

[0001]多肽用于各种应用领域。由于多肽具有多个官能团，例如N末端的NH2基团、C末端的COOH基团以及通常与多肽链或与侧链直接键合的一个或多个另外的官能团，因此与其他化合物的偶联很复杂。通常，会形成副产物，所述副产物会降低所需产物的产率，并且难以与所需产物分离。
[0002]人胰岛素是51个氨基酸残基的多肽，其分为2条氨基酸链：具有21个氨基酸残基的A链和具有30个氨基酸残基的B链。所述链借助2个二硫桥彼此连接。在A链的位置6与11处的半胱氨酸之间存在第三个二硫桥。目前用于治疗糖尿病的一些产品是胰岛素类似物，即胰岛素变体，其序列与人胰岛素序列的不同之处在于A链和/或B链中的一个或多个氨基酸取代。
[0003]与许多其他肽激素一样，人胰岛素的体内半衰期很短。因此，它被频繁施用，这与患者的不适相关。因此，需要这样的胰岛素类似物，其具有增加的体内半衰期，并且因此具有延长的作用持续时间。
[0004]WO 2008/034881A1(Novo Nordisk,Nielsen)公开了蛋白酶稳定的胰岛素类似物。
[0005]在另一种方法中，使长链脂肪酸基团与胰岛素的LysB29的ε氨基缀合。此基团的存在允许胰岛素通过非共价的可逆结合与血清白蛋白附接。因此，此胰岛素类似物相对于人胰岛素具有显著延长的时间
‑
作用曲线(参见例如Mayer等人,Inc.Biopolymers(Pept Sci)88:687
‑
713,2007；或WO 2009/115469 A1(Novo Nordisk,Madsen))。包含胰岛素类似物和允许胰岛素通过非共价、可逆结合与血清白蛋白附接的共价附接官能团的另一种缀合物公开于WO 2017/032798A1(Novo Nordisk,Madsen)中：在这里，描述了人胰岛素的酰化类似物，所述胰岛素类似物是通过用基团[酰基]‑
[接头]‑
使在A22位置处的赖氨酸残基的ε氨基基团酰化而衍生的，其中所述接头基团是由从1至10个选自以下的氨基酸残基组成的氨基酸链：gGlu(γ谷氨酸残基)和/或OEG(8
‑
氨基
‑
3,6
‑
二氧杂辛酸的残基)。
[0006]合成此类缀合物(即其中胰岛素类似物与另一个分子偶联，这反过来允许胰岛素(类似物)通过非共价、可逆结合与血清白蛋白附接)的一个障碍是所述偶联步骤通常导致产率不佳并且需要大量的后处理和纯化步骤，这会进一步降低产率。

技术实现思路

[0007]本文提供了一种形成磺酰胺与多肽的缀合物的方法，所述方法能够在缀合物合成中实现更高的总产率，即多于20％、或多于30％、或多于40％、或多于50％的产率，基于所使用的多肽。所述方法描述于下文中的部分A中。
[0008]进一步提供了一种用于产生白蛋白结合剂与胰岛素多肽的缀合物的方法，所述方法包括：a)提供从N末端到C末端包含胰岛素B链、接头肽和胰岛素A链的胰岛素原，b)将步骤a)中提供的胰岛素原用第一蛋白酶在所述胰岛素B链的最后一个氨基酸与所述接头肽的第一个氨基酸之间切割，从而产生胰岛素前体，所述胰岛素前体包含所述胰岛素B链和含有所述接头肽和所述A链的N末端延伸的A链，c)使所述胰岛素前体与白蛋白结合剂接触，从而产
生白蛋白结合剂与所述胰岛素前体的缀合物，d)将所述缀合物所包含的所述胰岛素前体的N末端延伸的A链用第二蛋白酶在所述接头肽的最后一个氨基酸与所述A链的第一个氨基酸之间切割，从而产生白蛋白结合剂与成熟胰岛素的缀合物。所述方法描述于下文中的部分B中。
具体实施方式
[0009]部分A：形成磺酰胺与多肽的缀合物的方法
[0010]为了提高缀合物合成的产率，所需步骤的数量以及副产物的数量和比率起着主要作用。因此，存在对于具有减少数量的步骤并且至少具有所需产物与不需要的副产物的更有利的比率的合成途径的需要。
[0011]出乎意料的是，发现使用特异性活化的磺酰胺与所述多肽进行偶联反应有助于改善所需产物与不需要的副产物的比率。此外，多肽前体的使用与特定酶的使用进行组合能够实现所谓的“一锅”反应，即用于得到最终多肽的活化磺酰胺的偶联和多肽前体的切割可以在一个反应容器中进行而无需分离或中间的纯化步骤。可以避免对磺酰胺使用另外的保护基团，这也减少了对于中间的分离或纯化步骤的需要。所需产物即磺酰胺与多肽的缀合物可以以50％或更高的产率获得。
[0012]因此，在第一方面，本文提供了一种形成磺酰胺与多肽的缀合物的方法，所述方法包括：
[0013]a)提供活化磺酰胺，其中所述活化磺酰胺对应于式(I)：
[0014][0015]其中
[0016]A选自氧原子、
‑
CH2CH2‑
基团、
‑
OCH2‑
基团和
‑
CH2O
‑
基团；
[0017]E表示
‑
C6H3R
‑
基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
[0018]X表示氮原子或
‑
CH
‑
基团；
[0019]m是从5至17范围内的整数；
[0020]n是零或从1至3范围内的整数；
[0021]p是零或1；
[0022]q是零或1；
[0023]r是从1至6范围内的整数；
[0024]s是零或1；
[0025]t是零或1；
[0026]R1表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基基团和卤化的C1至C3烷基基团的至少一个残基；
[0027]R2表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基基团和卤化的C1至C3烷基基团的至少
[0043]艾塞那肽具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:99)：
[0044]His
‑
Gly
‑
Glu
‑
Gly
‑
Thr
‑
Phe
‑
Thr
‑
Ser
‑
Asp
‑
Leu
‑
Ser
‑
Lys
‑
Gln
‑
Met
‑
Glu
‑
Glu
‑
Glu
‑
Ala
‑
Val
‑
Arg
‑
Leu
‑
Phe
‑
Ile
‑
Glu
‑
Trp
‑
Leu
‑
Lys
‑
Asn
‑
Gly
‑
Gly
‑
Pro
‑
Ser
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种形成磺酰胺与多肽的缀合物的方法，所述方法包括：a)提供活化磺酰胺，其中所述活化磺酰胺对应于式(I)：其中A选自氧原子、
‑
CH2CH2‑
基团、
‑
OCH2‑
基团和
‑
CH2O
‑
基团；E表示
‑
C6H3R
‑
基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；X表示氮原子或
‑
CH
‑
基团；m是从5至17范围内的整数；n是零或从1至3范围内的整数；p是零或1；q是零或1；r是从1至6范围内的整数；s是零或1；t是零或1；R1表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基基团和卤化的C1至C3烷基基团的至少一个残基；R2表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基基团和卤化的C1至C3烷基基团的至少一个残基；R
x
表示活化基团；其中对于式(I)，排除s是1、p是零、n是零、A是氧原子并且t是1的组合；b)提供具有游离氨基基团的多肽的水溶液，其中所述水溶液任选地包含醇；c)使b)的所述水溶液与a)的所述活化磺酰胺接触；以及d)使所述活化磺酰胺与所述具有游离氨基基团的多肽反应，获得包含所述磺酰胺与多肽的缀合物的溶液，其中所述磺酰胺与所述多肽共价键合。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法是形成磺酰胺与胰岛素多肽的缀合物的方法，任选地其中所述活化磺酰胺是活化白蛋白结合剂。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中进行根据步骤c)的使b)的所述水溶液与a)的所述活化磺酰胺接触，其中将a)的所述活化磺酰胺以所述活化磺酰胺的溶液的形式添加到b)的所述水溶液中。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，进行根据步骤c)的使b)的所述水溶液与a)的所述活化磺酰胺接触，其中将a)的所述活化磺酰胺以固体形式或至少部分呈结晶形式或至少90重量％呈结晶形式添加到b)的所述水溶液中；优选其中步骤d)包括：d.1)使所述活化磺酰胺与所述具有游离氨基基团的多肽的前体在从9至12范围内、或
在从9.5至11.5范围内、或在从10至11范围内的pH下反应，获得包含所述磺酰胺和所述多肽的前体的预缀合物，其中所述磺酰胺通过在式(I)的(活化)磺酰胺的
‑
C(＝O)
‑
O(R)与所述多肽的前体的氨基基团之间形成的酰胺键C(＝O)
‑
NH
‑
与所述多肽的前体共价键合；d.2)使根据d.1)获得的所述预缀合物的多肽的前体任选地在低于9的范围内的pH下或在7至9的范围内的pH下进行酶促消化，获得包含所述磺酰胺与所述多肽的缀合物的溶液。5.一种从根据权利要求1至4中任一项所述的方法获得或可获得的缀合物。6.一种N末端延伸的胰岛素A链，所述N末端延伸的胰岛素A链从N末端到C末端包含：(a)接头肽、和(b)胰岛素A链，其中所述N末端延伸的胰岛素A链包含在所述接头肽的最后一个氨基酸与所述A链的第一个氨基酸之间的对于胰蛋白酶的切割位点。7.一种胰岛素前体，所述胰岛素前体包含根据权利要求6所述的N末端延伸的胰岛素A链和胰岛素B链。8.一种用于使对应于式(I)的活化磺酰胺结晶的程序其中A、E、X、m、n、p、q、r、s、t、R1、R2和R
x
具有根据权利要求1所述的含义，所述程序包括A)提供包含所述活化磺酰胺和有机溶剂的溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：