本发明专利技术涉及一种改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的细胞，所述方法包括：(i)将悬浮培养物的一部分转移到容器中，其中所述容器在底部包括至少一个开口；(ii)使包含在所述悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在所述容器的底部的至少一个开口处，从而形成上清液；(iii)将沉降在所述容器的底部的细胞分配(回)到悬浮培养物中；(iv)弃去上清液。(iv)弃去上清液。(iv)弃去上清液。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于悬浮细胞的自动培养基更换策略
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求在2019年12月11日提交的欧洲专利申请第19 215091.0号的优先权的权益，其内容通过引用以其整体并入本文以用于所有目的。
[0003]本专利技术涉及一种改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在培养基中的细胞。
技术介绍
[0004]传统上，诱导多能干细胞(iPSC)和其它贴壁细胞在静态细胞培养容器(“2D培养”)中培养和扩增。由于它们的贴壁特性，这种培养形式允许容易地改变培养基：除去用过的培养基，而贴壁细胞保留在细胞培养容器的表面上。然而，2D培养仅在有限程度上可放大和自动化，这导致高的人工和成本密集型工作量，例如在GMP条件下产生大量用于临床治疗的细胞和商业治疗性细胞产品。
[0005]关于商业生物工艺开发，在搅拌式生物反应器中的悬浮培养物中的培养是传统2D培养的有吸引力的替代方案。例如，在文献中已经多次描述了以iPSC聚集物的形式悬浮培养iPSC(“3D培养”)(Olmer等人,2012；Kwok等人,2018；Amit等人,2010)。3D悬浮培养提供了开发有效、可再现和可规模化的生物工艺的可能性，其中培养参数如pH、溶解氧(DO)和温度可控。
[0006]与传统的2D培养相反，改变悬浮培养物中的培养基仍然是一种挑战，因为必须从培养基中分离并且保留细胞/细胞聚集物，同时去除用过的培养基。在生物工艺中，这可以以传统的方式通过灌注解决。已经描述的另一种可能性是中断细胞/细胞聚集物的搅拌和沉降，随后除去培养基并加入新鲜培养基(参见，例如Kwok等人,2018)。然而，搅拌的长时间中断可能导致形成更大的聚集物(聚集物融合)。这导致形成较大的、不均匀的聚集物，进而导致质量传递和信号梯度的差异以及自发分化和细胞聚集物中多能性的降低(Lipsitz等2018，也参见实施例1)。
[0007]US2016/0215257公开了用于包含干细胞和/或分化细胞的细胞聚集物的扩增和传代的方法，并且包括在搅拌釜式生物反应器中使用封闭系统。WO 2013/109520公开了包括细胞聚集物捕获器的灌注式生物反应器系统。US 2017/0191022公开了使用声学滤波器来保留细胞。
[0008]因此，仍然需要改变悬浮培养的培养基的方法，特别是其中整个过程可以在不从系统中除去细胞或聚集物并且不将细胞暴露于与长时间沉降和/或离心相关的压力的情况下进行。本专利技术旨在解决这种需要。
技术实现思路
[0009]这种需要通过权利要求中限定的主题来解决。本文展示了一种改变悬浮培养物的
培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的细胞。
[0010]因此，本专利技术涉及一种改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的细胞，所述方法包括：
[0011](i)将悬浮培养物的一部分转移到容器中，其中所述容器在底部包含至少一个开口；
[0012](ii)使包含在悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在容器的底部的至少一个开口处，从而形成上清液；
[0013](iii)将沉降在容器的底部的细胞分配(回)到悬浮培养物中；
[0014](iv)弃去上清液。
[0015]所述方法可以在生物反应器中进行。所述生物反应器可以是搅拌式生物反应器(STR)、摇摆式生物反应器(RM)和/或多并行生物反应器。
[0016]所述悬浮培养物可以连续搅拌。
[0017]所述细胞可以基本上均匀地分布在所述培养基中。
[0018]所述容器可以是管状的。容器可具有圆锥形底部。容器可以是移液管尖端、(一次性使用的)袋或(一次性使用的)袋的圆锥形/锥形部分。
[0019]可以在步骤(i)中将所述悬浮培养物的部分吸取到所述容器中。
[0020]所述细胞可以是真核细胞、真菌细胞如酵母细胞如P.pastoris、昆虫细胞如Drosophila melanogaster S2和Spodoptera frugiperda Sf9细胞、细菌细胞如E.coli、Streptomyces和Salmonella typhimurium、或植物细胞。优选地，所述细胞是真核细胞。
[0021]所述细胞可以是悬浮培养的贴壁细胞。
[0022]所述细胞可以选自由原代细胞、从组织或器官获得的细胞、永生化细胞、多能干细胞组成的组，优选所述细胞是多能干细胞，优选诱导多能干细胞(iPSC)、或iPSC衍生的细胞。所述细胞可以选自由TC
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1133、Gibco ATCC ACS
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1004的Human Episomal iPSC系、ATCC ACS
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1021、ATCC ACS
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1025、ATCC ACS
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1027、ATCC ACS
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1030、HEK293、HEK293T、BHK 21、CHO、NS0和Sp2/0
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Ag14组成的列表。所述细胞可以是人或非人的。
[0023]所述细胞可以是细胞聚集物。所述细胞聚集物的平均直径可以为约50至800μm、约150至800μm、至少约800μm、至少约600μm、至少约500μm、至少约400μm、至少约300μm、至少约200μm、至少约150μm、约300至500μm、约150至300μm、约50至150μm、约80至100μm、约180至250μm或约200至250μm。
[0024]所述方法还可以包括：(v)向悬浮培养物中添加与上清液等体积的培养基。
[0025]在本专利技术方法的步骤(ii)中，使所述细胞沉降的时间可以是至少1min、至少2min、至少3min、至少4min、至少5min、至少6min、至少7min、至少8min、至少9min、至少10min、至少11min、至少12min、至少13min、至少14min、至少15min、至少16min、至少17min、至少18min、至少19min或至少20min。
[0026]在步骤(iii)中，步骤(i)中转移的细胞的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97.5％、至少99％或基本上所有细胞可以分配(回)到悬浮培养物中。
[0027]所述细胞可以在微载体颗粒上生长。所述悬浮培养物可以是微载体培养物。
[0028]在本专利技术方法的步骤(ii)中，所述悬浮液的部分可以保持静止，从而使包含在悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在容器的底部的至少一个开口处。
[0029]在本专利技术方法的步骤(i)中，所述悬浮液的部分可以通过所述容器的底部的至少一个开口转移到所述容器中。
[0030]在本专利技术方法的步骤(iii)中，将沉降在所述容器的底部的细胞通过所述容器的底部的至少一个开口分配(回)到悬浮培养物中。
附图说明
[0031]当结合非限制性实施例和附图考虑时，参本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的细胞，所述方法包括：(i)将所述悬浮培养物的一部分转移到容器中，其中所述容器在底部包含至少一个开口；(ii)使包含在所述悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在所述容器的底部的至少一个开口处，从而形成上清液；(iii)将沉降在所述容器的底部的细胞分配(回)到所述悬浮培养物中；(iv)弃去上清液。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在生物反应器中进行，其中所述生物反应器优选为搅拌式生物反应器、摇摆式生物反应器和/或多并行生物反应器。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中连续搅拌所述悬浮培养物；和/或其中所述细胞基本上均匀地分布在所述培养基中。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述容器是管状的；和/或其中所述容器具有圆锥形底部；和/或其中所述容器是移液管尖端、(一次性使用的)袋或(一次性使用的)袋的圆锥形/锥形部分。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中将所述悬浮培养物的部分吸取到所述容器中。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞如人细胞、真菌细胞如酵母细胞如P.pastoris、昆虫细胞如Drosophila melanogaster S2和Spodoptera frugiperda Sf9细胞、细菌细胞如E.coli、Streptomyces和Salmonella typhimurium细胞、或植物细胞。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是悬浮培养的贴壁细胞。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由原代细胞、从组织或器官获得的细胞、永生化细胞、多能干细胞组成的组，优选地所述细胞是多能干细胞，更优选诱导多能干细胞(iPSC)。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由TC
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1133、Gibco ATCC ACS
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1004的Human Episomal iPSC系、ATCC ACS
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1021、ATCC ACS
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1025、ATCC ACS
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1027、ATCC ACS
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1030、HEK293、HEK...
【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：修复股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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