一种定量检测视黄酸异构体的方法技术

本发明专利技术提供了一种同时检测三种RA异构体的方法，包括蛋白变性、萃取、复溶、液相色谱

A method for quantitative detection of retinoic acid isomers

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测视黄酸异构体的方法


[0001]本专利技术涉及检测领域，具体涉及视黄酸及异构体的检测方法。

技术介绍

[0002]维生素A(Vitamin A，VA)，即视黄醇(Retinol,Re)，是人体必需的一种脂溶性维生素，它在正常的胚胎发生、发育以及视觉、免疫、繁殖和维持上皮组织分化等方面都发挥着非常重要的作用。Re首先通过一个可逆的限速反应脱氢生成视黄醛，接着在视黄醛脱氢酶的作用下进行一个不可逆的脱氢反应生成视黄酸(Retinoic acid，RA)，从而发挥生理作用。
[0003]世界卫生组织(WHO)推荐使用血清Re浓度用于评估个体VA的营养水平，但人体只有当肝脏VA储备处于严重耗竭(＜0.07μmol/g肝)或极高(＞1.05 μmol/g肝)状态时，血清Re的水平才可能反映VA的营养状况。在这两个极端状态之间，血清Re通过自我调节保持稳态，因而，血清Re并不总是与VA摄入或缺乏的临床体征相关，所以，实际上血清Re水平并不完全适用于评估个体即时的VA状况，且对干预措施的反应也不够灵敏。此外，Re在体内并不直接发挥生物学作用，而是通过其活性代谢产物——RA，RA通过与其核受体(RARs) 结合调控靶基因转录水平，从而参与神经元发育、胚胎发生等重要生物学作用，所以评估RA的浓度更能体现人体即刻VA的营养水平。
[0004]此外，全反式维甲酸(atRA)已经广泛应用于急性早幼粒细胞白血病的治疗，并有报道称其在缺血性脑中风、干燥性结膜炎、甚至肺癌的治疗中都起着重要作用。但作为小分子脂溶性化合物，atRA在体内容易累积，过量的RA可能引起口唇黏膜干燥、头痛、消化道症状甚至呼吸窘迫综合征等RA中毒表现。所以对使用RA类药物的患者，及时监测体内RA浓度非常重要。
[0005]据报道，RA至少存在以五种同分异构体，atRA、9
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cisRA、13
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cisRA、 9,13
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dicisRA和11
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cisRA。RA的几种不同的同分异构体与核受体有不同的亲和性，因此发挥不同的生物学作用。如，atRA激活视黄酸受体(Retinoic acid receptor, RAR)，9
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cis
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RA(9cRA)同时激活RAR和另一类视黄酸受体(Retinoid X receptor, RXR)。13
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cis
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RA(13cRA)不会直接激活RAR或RXR，但最有可能通过转化为 atRA，诱发血脂异常和胰岛素抵抗。RAR受体和RXR受体在多种调节机制中发挥着重要作用，所以，将RA的几种同分异构体分别定量是非常必要的。
[0006]然而，人体内源性RA的浓度低，为pg级，既往的检测方法很难达到内源性浓度的定量限要求。近年来，因为超高效液相色谱串联质谱(UPLC
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MS/MS) 技术的普及，使得内源性RA的定量成为可能。但已报道的UPLC
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MS/MS方法仍存在一些问题，如：(1)样本的需求量大，多需要1ml以上血清；(2)试剂消耗量大，每个样本的提取需要约50ml的有机试剂进行蛋白变性和萃取操作，大量有机试剂的接触易对实验人员的健康造成损害；(3)视黄酸的三种同分异构体分离不完全；(4)检测耗时长，一个样本的检测时间最短需要30分钟。因此，既往报道的方法皆不能适用于临床大样本的检测。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种同时检测血清维生素A及其代谢产物的方法，该方法对于微量血清样本RA及其同分异构体的检测表现优异。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]一种同时检测三种RA异构体的方法，包括蛋白变性、萃取、复溶、液相色谱
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质谱联用检测，所述蛋白变性试剂为内标
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提取剂，其配方含有20ng/mL的 atRA
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d6同位素内标和1％甲酸的甲醇
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乙腈混合液。优选的，所述甲醇与乙腈体积比为6:4。
[0010]优选的，上述萃取试剂为正己烷。
[0011]优选的，上述复溶试剂为60％乙腈水溶液。
[0012]优选的，上述液相色谱
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质谱联用检测采用C18色谱柱，以0.1％甲酸
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水溶液为流动相A，0.1％甲酸
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乙腈溶液为流动相B，以45℃柱温进行梯度液相洗脱，总时间为7.5分钟。具体梯度见表1。
[0013]上述液相色谱
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质谱联用检测包括质谱调谐，调谐参数为：离子源ESI+，毛细管电压3.0kV，锥孔电压10V，离子源温度150℃，去溶剂温度450℃，碰撞气流速0.15mL/min。
[0014]一种同时检测三种RA异构体的方法，检测方法包括如下步骤：
[0015](1)蛋白变性：取血清样本100μL放入棕色EP管中，加入内标
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提取剂 150μL，涡旋震荡，转速为2000rpm，时间为2min；然后将各棕色EP管离心，转速3000rpm，时间2min，温度为4℃；
[0016](2)萃取：在棕色EP管中加入正己烷1mL；涡旋混匀，转速为2000rpm，时间为30min；然后将深孔板离心，转速为14,000rpm，时间为10min，温度为 4℃；
[0017](3)氮吹和复溶：将棕色EP管中的上层正己烷层800μL移至新的96孔深孔板；在氮气下吹干，氮气流速为10mL/min；吹干后，在各吹干的深孔板中加入60％乙腈80μL；涡旋混匀5min，4℃离心2min，转速2000rpm。
[0018](4)将深孔板中液体转移至96孔板(V形底)中，封铝膜，待测。
[0019](5)使用液质联用仪分析复溶液中的RA异构体，通过内标法即通过RA 异构体与其氘代内标物的离子强度比值(纵轴)和二者的浓度之比(横轴)计算样本血浆(清)的脂溶性维生素含量。
[0020]优选的，上述方法建立准确的标准回归曲线，供计算样本血清的RA异构体含量，其回归曲线的建立方法为：将血清替换为含有五种或五种以上梯度浓度 atRA，9cisRA与13cisRA的标准品溶液。
[0021]本专利技术所述百分比如无特别注明，即为质量百分比。
[0022]有益效果
[0023]1、本专利技术专用于分析Re代谢转化生成的具有生物活性作用的多种RA异构体，本方法只需100μl血清即可对样本中的atRA，9cisRA与13cisRA进行分离与检测；灵敏度高，三种同分异构体均能达到内源性浓度的定量限需求；检测耗时短，一个样本的检测只需要不到8分钟；且操作简单，无需衍生化，具有广阔的临床应用前景。
[0024]2、本专利技术可以同时检测血清中3种RA异构体，定量限可达皮克级，该方法对于微量样本(仅100μl血清)的检测稳定性和重复性表现优异。本专利技术检测时间较短，7.5分钟/样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测三种RA异构体的方法，包括蛋白变性、萃取、复溶、液相色谱
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质谱联用检测，所述蛋白变性试剂为内标
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提取剂，其配方含有20 ng/mL的atRA
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d6同位素内标和1 %甲酸的甲醇
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乙腈混合液。2.如权利要求1所述的同时检测三种RA异构体的方法，所述萃取试剂为正己烷。3.如权利要求1或2所述的同时检测三种RA异构体的方法，所述复溶试剂为60%乙腈。4.如权利要求1
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3任一所述的同时检测三种RA异构体的方法，所述液相色谱
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质谱联用检测采用C18色谱柱，以0.1%甲酸
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水溶液为流动相A，0.1%甲酸
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乙腈溶液为流动相B，以45 ℃柱温进行梯度液相洗脱，总时间7.5分钟。5.如权利要求1
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4任一所述的同时检测三种RA异构体的方法，所述液相色谱
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质谱联用检测包括质谱调谐，调谐参数为：离子源ESI+，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压10 V，补偿电压50 V，离子源温度150 ℃，去溶剂温度450 ℃，锥孔流速150 L/Hr，去溶剂流速900 L/Hr...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗静琨，李廷玉，冯钰茹，刘浩，杨亭，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：