重组人干扰素的含量检测方法技术

本发明专利技术涉及一种重组人干扰素的含量检测方法，包括如下步骤：构建重组人干扰素的峰面积

Determination of recombinant human interferon

【技术实现步骤摘要】
重组人干扰素的含量检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种重组人干扰素的含量检测方法。

技术介绍

[0002]重组人干扰素具有广泛的抗病毒作用，主要通过干扰素同靶细胞表面干扰素受体结合，诱导多种抗病毒蛋白，阻止病毒蛋白质的合成、抑制病毒核酸的复制和转录，同时还具有多重免疫调节作用，可提高巨噬细胞的吞噬活性，促进和维护机体的免疫监视、免疫防护、免疫自稳功能。
[0003]人们对重组人干扰素的研究已长达几十年，对于重组人干扰素的含量检测方法也不断创新。目前对于重组人干扰素α1b的含量检测，常用的方法按检测目的主要分为两类：一类是检测具有生物学活性的干扰素含量检测方法，包括空斑减少法、细胞病变抑制试验和病毒定量法，另一类是检测干扰素化学含量的方法，包括ELISA法、lowry法和微量紫外分光光度计直接定量法等。其中ELISA法由于其专一性，既可以用来检测纯度较高的重组人干扰素样品，也可以检测成分复杂、纯度较低的重组人干扰素样品，如重组人干扰素α1b工程菌发酵后破菌上清样品，其中包含大量的杂蛋白、核酸和多糖等，重组人干扰素α1b只占一小部分。ELISA法检测人干扰素含量的原理是：人干扰素单克隆抗体包被在微孔反应板上，待测样品和标准品中的干扰素会与人干扰素单克隆抗体结合，游离的成分被洗去；随后加入辣根过氧化物酶标记的二抗与干扰素结合，游离的成分被洗去；加入显色剂，若反应孔中有干扰素，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂呈现蓝色，加终止液变黄色，根据显色深浅可以判断人干扰素存在与否或量的多少。但是，在实际检测中发现，以ELISA法进行发酵后破菌上清样品中重组人干扰素α1b的含量检测时重复性较差，回收率不稳定，因此检测数据参考价值低。
[0004]另外，还有方法提供一种亲和层析定量检测重组人α干扰素工艺中间体含量的方法。该方法的步骤包括：表达重组人α干扰素的工程菌构建，发酵工程菌得到以可溶性蛋白或包涵体形式表达的目的蛋白，然后经过粗纯和DEAE阴离子交换柱层析得到中间体，再用单抗胶亲和层析柱定量检测中间体中重组人α干扰素的含量。该方法特征有：
①
单抗胶层析柱定量检测的样品为中间体，经过了粗纯和DEAE阴离子交换柱层析，样品纯度较高；
②
所用的单抗胶层析柱为制备级层析柱，所用设备为制备级纯化仪，造成检测时样品需求量较大，单个样品检测时间长；
③
重组人α干扰素的含量检测范围为0.5～30mg/mL。因此该方法对检测样品的纯度有要求，仅适用于经过了初步纯化的高纯度样品，样品需求量较大，且含量检测范围偏高，不适用于检测成分复杂、含量低的样品。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术提供一种样品需求量小，适用于检测成分复杂、重组人干扰素含量低的样品(如重组人干扰素α1b工程菌发酵后破菌上清样品)，且检测结果准确的重组人干扰素的含量检测方法。
[0006]具体技术方案如下：
[0007]一种重组人干扰素的含量检测方法，包括如下步骤：
[0008]配制不同浓度的重组人干扰素对照品溶液；
[0009]对所述不同浓度的重组人干扰素对照品溶液进行亲和高效液相色谱检测，构建重组人干扰素的峰面积
‑
浓度标准曲线；
[0010]对待测样品进行亲和高效液相色谱检测，将检测结果代入所述重组人干扰素的峰面积
‑
浓度标准曲线进行计算，获得所述待测样品中重组人干扰素的含量；
[0011]其中，所述亲和高效液相色谱检测采用的色谱柱包含填料，所述填料为偶联有重组人干扰素单克隆抗体的琼脂糖凝胶；
[0012]所述亲和高效液相色谱检测采用的洗脱程序包括：
[0013](1)以平衡液平衡所述色谱柱，所述平衡液的组成包括十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以及氯化钠；
[0014](2)以第一洗脱液对所述色谱柱进行第一次洗脱，所述第一洗脱液的组成包括十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、氯化钠以及吐温20；
[0015](3)以所述平衡液平衡所述色谱柱；
[0016](4)以第二洗脱液对所述色谱柱进行第二次洗脱，所述第二洗脱液的组成包括甘氨酸。
[0017]在其中一个实施例中，所述第一洗脱液中，所述十二水磷酸氢二钠的浓度为5.4～6.6g/L，所述二水磷酸二氢钠的浓度为1～1.6g/L，所述氯化钠的浓度为57～60g/L，所述吐温20的浓度为4～6mL/L。
[0018]在其中一个实施例中，所述第一洗脱液的pH值为6.5
±
0.2，电导率为82.5
±
3mS/cm。
[0019]在其中一个实施例中，所述第二洗脱液中，所述甘氨酸的浓度为1～1.6g/L。
[0020]在其中一个实施例中，所述第二洗脱液的pH值为2.5
±
0.2，电导率为2.4
±
0.5mS/cm。
[0021]在其中一个实施例中，所述平衡液中，所述十二水磷酸氢二钠的浓度为5.4～6.6g/L，所述二水磷酸二氢钠的浓度为1～1.6g/L，所述氯化钠的浓度为7～8g/L；
[0022]及/或所述平衡液的pH值为7.0
±
0.2，电导率为15
±
2mS/cm。
[0023]在其中一个实施例中，所述亲和高效液相色谱检测采用的洗脱程序包括：
[0024]0～2min，以所述平衡液平衡所述色谱柱；
[0025]2～3min，溶液切换；
[0026]3～10min，以所述第一洗脱液对所述色谱柱进行第一次洗脱；
[0027]10～11min，溶液切换；
[0028]11～25min，以所述平衡液平衡所述色谱柱；
[0029]25～26min，溶液切换；
[0030]26～35min，以所述第二洗脱液对所述色谱柱进行第二次洗脱。
[0031]在其中一个实施例中，所述亲和高效液相色谱检测的条件还包括：流速为0.7～0.9mL/min，温度为23℃～27℃，紫外检测器波长为275nm～285nm；
[0032]及/或所述待测样品为经过离心处理的发酵后破菌上清样品；所述离心的条件包
括：转速为11500rpm～12500rpm，时间为2min～10min。
[0033]在其中一个实施例中，所述含量检测方法的定量限≥20μg/mL。
[0034]在其中一个实施例中，所述重组人干扰素为IFNα1b、IFNα2b或IFNα2a。
[0035]上述重组人干扰素的含量检测方法，采用偶联有重组人干扰素单克隆抗体的琼脂糖凝胶作为色谱柱填料，结合合适的洗脱程序，能够实现杂质的有效分离以及待测样品中重组人干扰素含量的准确检测，适用于检测如重组人干扰素的发酵表达量等参数。
[0036]同时，该含量检测方法既可检测纯度较高的重组人干扰素样品，也可以检测成分复杂的重组人干扰素样品，如破菌上清样品中重组人干扰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人干扰素的含量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：配制不同浓度的重组人干扰素对照品溶液；对所述不同浓度的重组人干扰素对照品溶液进行亲和高效液相色谱检测，构建重组人干扰素的峰面积
‑
浓度标准曲线；对待测样品进行亲和高效液相色谱检测，将检测结果代入所述重组人干扰素的峰面积
‑
浓度标准曲线进行计算，获得所述待测样品中重组人干扰素的含量；其中，所述亲和高效液相色谱检测采用的色谱柱包含填料，所述填料为偶联有重组人干扰素单克隆抗体的琼脂糖凝胶；所述亲和高效液相色谱检测采用的洗脱程序包括：(1)以平衡液平衡所述色谱柱，所述平衡液的组成包括十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以及氯化钠；(2)以第一洗脱液对所述色谱柱进行第一次洗脱，所述第一洗脱液的组成包括十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、氯化钠以及吐温20；(3)以所述平衡液平衡所述色谱柱；(4)以第二洗脱液对所述色谱柱进行第二次洗脱，所述第二洗脱液的组成包括甘氨酸。2.根据权利要求1所述的重组人干扰素的含量检测方法，其特征在于，所述第一洗脱液中，所述十二水磷酸氢二钠的浓度为5.4～6.6g/L，所述二水磷酸二氢钠的浓度为1～1.6g/L，所述氯化钠的浓度为57～60g/L，所述吐温20的浓度为4～6mL/L。3.根据权利要求1所述的重组人干扰素的含量检测方法，其特征在于，所述第一洗脱液的pH值为6.5
±
0.2，电导率为82.5
±
3mS/cm。4.根据权利要求1所述的重组人干扰素的含量检测方法，其特征在于，所述第二洗脱液中，所述甘氨酸的浓度为1～1.6g/L。5.根据权利要求1所述的重组人干扰素的含量检测方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈芬，杜保平，张超，王伟，马鸿杰，肖文桥，
申请(专利权)人：深圳科兴药业有限公司，
类型：发明
国别省市：