多杀菌素衍生物作为精氨酸代琥珀酸合成酶激活剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了多杀菌素A(Spinosyn A)及其衍生物作为精氨酸代琥珀酸合成酶1(ASS1)和突变型精氨酸代琥珀酸合成酶ASS1

Spinosad derivatives as activators of arginine succinate synthetase and their applications

【技术实现步骤摘要】
多杀菌素衍生物作为精氨酸代琥珀酸合成酶激活剂及其应用
[0001]本专利技术是多杀菌素衍生物作为精氨酸代琥珀酸合成酶激活剂及其应用的分案申请，母案的申请日为2020年5月7日，申请号为202010375736.2，申请名称为多杀菌素衍生物作为精氨酸代琥珀酸合成酶激活剂及其应用。


[0002]本专利技术涉及多杀菌素A(Spinosyn A)及其衍生物可调节激活精氨酸代琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthetase 1,ASS1)。该类化合物可作为氨酸代琥珀酸合成酶缺陷相关疾病的治疗，如抗肿瘤、瓜氨酸血症，属于医药领域。

技术介绍

[0003]精氨酸代琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase，ASS1；EC 6.3.4.5)首先在肝脏中发现，后来在哺乳动物中被认为是普遍存在的酶。ASS1基因位于染色体9q34.11，基因长度为56kb，开放阅读框长度1239bp，带有16个外显子，编码412个氨基酸，分子量为 46kDa。ASS1催化瓜氨酸和天冬氨酸在ATP功能的条件下生成精氨酸代琥珀酸，该化合物在精氨酸代琥珀酸裂解酶的作用下进一步分解为精氨酸和延胡索酸，其中，精氨酸进一步进入尿素循环或用于蛋白质合成等代谢过程。其中尿素循环可以将有毒的氨转化为无毒的尿素排出体外，是体内解氨毒的主要途径。如果ASS1表达下调或突变，其酶催化活性下降或者缺乏，将使尿素循环受阻，出现瓜氨酸水平上升。精氨酸代琥珀酸合成酶(是尿素循环关键酶(见图2)。同时，天冬氨酸是ASS1的关键底物之一，ASS1表达量的高低及其活性将决定用于尿循环中的天冬氨酸利用度。ASS1低表达将限制天冬氨酸的利用。
[0004]瓜氨酸血症(Citrullinemia，CTLN)是一种常染色体隐性遗传的尿素循环障碍疾病，临床表现上主要为瓜氨酸增加和高氨血症，根据发病机制的不同分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型瓜氨酸血症(Citrullinemia type 1，CTLN 1)，是由于ASS1基因缺陷导致的，发病率约为 1/250,000，是第三大尿素循环障碍；Ⅱ型瓜氨酸血症(Citrullinemia type 2，CTLN 2)是由于Citrin基因突变所致。CTLN1在临床表现上主要为高氨血症的毒性现象，由发病时间及疾病的严重程度分为经典型和迟发型。经典型瓜氨酸血症于新生儿期发病，表现为高氨血症伴随着神经系统功能衰退，预后差，死亡率高；迟发型瓜氨酸血症则发病较晚，症状较轻，患者可能表现出反复出现的神经症状，如嗜睡、智力障碍等，有部分患者没有症状，只有在新生儿筛查中检测到的生化表型。
[0005]导致CTLN1的精氨酸琥珀酸合成酶基因缺陷的突变有很多，目前已被报道的突变有 137种，主要是错义突变，另外也有少数病例出现无义突变、异常剪接及缺失突变。前八种最常出现的突变类型为p.Gly390Arg、p.Trp179Arg、p.Gly362Val、p.Arg363Trp、 p.Gly324Ser、p.Arg157His、p.Arg304Trp以及p.Val263Met,分别对应出现在124、27、24、 17、16、14、13、以及12个病例中。有研究通过构建体外表达载体的方式体外表达了部分突变型ASS1并检测其酶活性，在突变率最高的前八位突变中，突变p.Gly390Arg、 p.Arg157His、p.Gly324Ser在体外实验中表现为完全失活，而突变p.Trp179Arg、 p.Val263Met、
p.Gly362Val在体外仍保留有部分酶活性。这个结果与其他报道携带这些突变的患者的临床表现基本一致。但目前为止还没有明确Ⅰ型瓜氨酸血症基因型与表型之间的相关性。有报道部分患者直到处于高分解代谢状态(手术期间和术后、产后或发烧)时才产生严重的高氨血症。
[0006]瓜氨酸血症是一种染色体异常的疾病，目前是没有根治的方法，治疗上主要是低蛋白饮食，降血氨治疗，如果症状比较严重，或者血氨过高，则要依靠血液或是腹腔透析治疗。因此专利技术治疗瓜氨酸血症的药物有十分重要的临床价值。
[0007]肿瘤细胞增殖速度快，需要更多的能量和营养物质，包括核苷酸、蛋白质、脂质等。 CAD[氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ(Carbamoylphosphate synthetaseⅡ，CPSase)、天冬氨酸转氨甲酰酶 (Aspartate transcarbamoylase,ATCase)和二氢乳清酸脱氢酶(Dihydroorotate hydrogenase， DHOase)]是嘧啶类核苷酸从头合成的关键限速酶。嘧啶类核苷酸从头生物合成如下所述：谷氨酰胺、二氧化碳在胞液中由ATP供能，氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ催化下，生成氨基甲酰磷酸。后者又在天冬氨酸转氨甲酰酶催化下，将氨基甲酰基转移到天冬氨酸的氨基上生成氨甲酰天冬氨酸。氨甲酰天冬氨酸脱水环化，生成二氢乳清酸，再脱氢即成乳清酸。乳清酸是嘧啶类核苷酸的必需前体。由此可知，天冬氨酸也是CAD的关键底物。肿瘤细胞异常增殖，就必须有更多的天冬氨酸参与合成核苷酸。
[0008]天冬氨酸含有两个羧基，极性大，食物等外源性天冬氨酸酸很难进入细胞中，细胞内的天冬氨酸的来源依赖于其内源性生物合成。天冬氨酸的分解代谢途径决定其在细胞内作用和功能。天冬氨酸是ASS1和CAD共同的底物，因此，ASS1和CAD二者竞争性利用天冬氨酸。
[0009]如果肿瘤细胞ASS1的下调或者缺陷，这导致其底物天冬氨酸的更多地用于嘧啶类核苷酸合成,促进细胞增殖。ASS1与肿瘤生长紧密相关，在一些肿瘤中，ASS1表达下调或存在缺陷，包括乳腺癌、黑素瘤、肝细胞癌、前列腺癌、膀胱癌、间皮瘤，卵巢癌、肾癌、胰腺恶性肿瘤、鼻咽癌、骨肉瘤和粘液纤维肉瘤等。ASS1缺陷与癌症预后不良之间存在明显相关性，被认为是抑癌蛋白，提示ASS1在多种肿瘤中表现为抑癌功能，特别在ASS1缺陷的肿瘤中，激活ASS1可以抑制经天冬氨酸途径合成肿瘤细胞增殖必需的嘧啶核苷酸。因此，我们认为ASS1蛋白可以成为潜在的抗肿瘤药物直接作用靶点。迄今为止，没有任何文献公开报道可以调节ASS1活性的化学小分子。
[0010]多杀菌素Spinosyn是土壤刺糖多胞菌(Saccharoplyspora spinosa)经过有氧发酵所产生的胞内次级代谢产物，是大环内酯类抗生素，具有杀虫活性。多杀菌素商品名为 Spinosad(SP)，其主要活性成分A(Spinosyn A，SPA,85
‑
90％)和D(Spinosyn D，10
‑
15％)， Spinosyn包含一个独特的四环结构，连接着两个不同的六元糖。SP作为广谱的生物农药，主要防治鳞翅目、缨翅目害虫。哺乳动物的慢性毒性实验表明，SP无致癌、致畸、致突变性或神经毒性，急性毒性试验表明，对哺乳动物的毒性低(老鼠口服(mg/kg)LD50＝3783
‑ꢀ
5000；老鼠皮肤(mg/kg)LD50＞2000)。
[0011]本专利技术公开了多杀菌素衍生物作为ASS1激活剂，可以激活A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多杀菌素衍生物及其在医学上可接受的盐在制备精氨酸代琥珀酸合成酶激活剂中的应用，其特征在于，所述多杀菌素衍生物具有以下结构式：
2.权利要求1所述的应用中的多杀菌素衍生物及其在医学上可接受的盐在制备治疗与精氨琥珀酸合成酶相关的疾病药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述精氨琥珀酸合成酶具体为蛋白ASS1和
ASS1
G362V
；所述蛋白ASS1和ASS1
G362V
的制备方法为：通过同源重组技术构建ASS1 pet28a质粒，后采用基因定点突变技术，构建ASS1
G362V pet28a质粒，将构建好的两种质粒分别转入大肠杆菌DH5a中进行原核表达并纯化蛋白ASS1和ASS1
G362V
。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述蛋白ASS1和ASS1
G362V
的制备步骤包括：S1、ASS1
‑
pET
‑
28a质粒构建(1)提取人乳腺癌细胞系HCC1806细胞系总RNA，RT
‑
PCR扩增ASS1基因，使用引物为(5
′‑3′
)：ASS1
‑
F：ACCCTCGAGGGATCCGAATTCATGTCCAGCAAAGGCTCC(SEQ ID NO 3)；ASS1
‑
R：AGACTGCAGGTCGACAAGCTTTTATTTGGCAGTGACCTT(SEQ ID NO 4)；(2)提取pET
‑
28a质粒，酶切、电泳胶回收后按同源重组的方法将ASS1基因整合到pET
‑
28a质粒中；(3)转化：将构建好的pET
‑
28a质粒转化到大肠杆菌DH5a中，筛选出阳性克隆送测序，对于测序正确的克隆扩大培...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗志勇，刘苏友，邹自征，胡息源，罗眺，陈筱丹，孔繁蓉，罗均利，罗文松，马大友，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：