一种基于稀土掺杂上转换纳米材料荧光探针的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于稀土掺杂上转换纳米材料荧光探针的制备方法，包括以下步骤：采用热分解法制备稀土掺杂上转换纳米材料NaY1‑

A preparation method of fluorescence probe based on rare earth doped up conversion nano materials

【技术实现步骤摘要】
一种基于稀土掺杂上转换纳米材料荧光探针的制备方法


[0001]本公开属于生物工程
，涉及一种基于稀土掺杂上转换纳米材料荧光探针的制备方法。

技术介绍

[0002]生物标志物miRNA与肿瘤、癌症等疾病之间存在很大联系，尤其是在疾病早期，人体血清中miRNA的含量还是比较低的，用常规的检测手段未必能够检测出来，并且miRNA具有序列同源性、易降解的特点，使得miRNA的检测在临床医学上的应用得到了限制。
[0003]而荧光分析法在众多miRNA检测分析法中占据较大优势，具有操作简便、灵敏度高，价格低廉等优点。但由于miRNA本身不发荧光，需要借助荧光基团进行荧光分析；荧光检测信号的表达主要取决于荧光探针，因此设计一种特异性好、灵敏度高的荧光探针是检测miRNA的关键所在。
[0004]上转换纳米材料(Upconversion Nanoparticles，简称UCNPs)的上转换发光辐射过程可将长波长的激发光转换为短波长的发射光，与传统的有机染料、量子点、荧光蛋白等生物分子标记物相比，稀土掺杂上转换纳米颗粒材料有极大优势，如近红外光作激发光、所造成的光损伤更小、生物组织的自荧光背景更低、穿透深度更强等。因此，UCNPs是做荧光探针中荧光基团部分的理想材料，对荧光探针的灵敏度有重要影响。其中，稀土离子的掺杂对UCNPs的发光性能和荧光寿命有着关键影响。掺杂主要分为单掺杂和双掺杂，单掺杂稀土上转换发光纳米材料对激发的红外光吸收的效率不高，发光效率比较低，而且过高的掺杂离子浓度会导致荧光淬灭。而双掺杂体系中由于多了敏化剂成分，其上转换量子效率显著提高，同时允许更低的掺杂离子浓度也使得荧光猝灭现象明显减少，能使荧光探针有更好的发光性能。
[0005]因此，制备灵敏度高、特异性好的荧光探针的关键点在于找到发光中心极即UCNPs材料所需的离子组合以及组合中各部分离子间的最优配比。另外，目前获得的UCNPs材料表面通常包裹有油酸、油胺、十八烯等疏水的有机配体，使其水溶性较差，也难以与生物分子连接，这对于荧光探针中识别基团的连接构成挑战。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种基于稀土掺杂上转换纳米材料荧光探针的制备方法，该方法能提高UCNPs的水溶性和生物兼容性，易与生物分子连接，所制备得到的荧光探针发光性能优越、灵敏度高且特异性好。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种基于稀土掺杂上转换纳米材料荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)采用热分解法制备稀土掺杂上转换纳米材料NaY1‑
x
‑
y
F4:Yb
x
Tm
y
，式中，x、y为Yb
3+
、Tm
3+
分别掺杂Y
3+
位的摩尔比，0.15≤x≤0.25，0.002≤y≤0.01，所述稀土掺杂上转换纳米材料的粒径为40
‑
50nm；
[0009](2)将步骤(1)得到的稀土掺杂上转化纳米材料进行水溶性处理得到水溶性的稀土掺杂上转换纳米材料；
[0010](3)对水溶性的稀土掺杂上转换纳米材料进行羧基化蛋白包裹得到表面含有羧基基团的稀土掺杂上转换纳米材料；
[0011](4)将表面含有羧基基团的稀土掺杂上转换纳米材料活化后与连接FAM的氨基化DNA探针相连得到具备荧光检测功能的荧光探针。
[0012]进一步的，步骤(1)中，热分解法具体步骤：
[0013](1
‑
1)将YCl3·
6H2O、YbCl3·
6H2O、TmCl3·
6H2O作为原料，按分子式NaY1‑
x
‑
y
F4：Yb
x
Tm
y
中各元素的化学计量比称取各原料，式中，x为Yb
3+
、Tm
3+
分别掺杂Y
3+
位的摩尔比，0.15≤x≤0.25，0.001≤y≤0.01，将上述各原料置于油酸和十八烯的混合溶液中，在惰性气体保护气的气氛下加热至160℃以上进行反应1h得到淡黄色溶液；
[0014](1
‑
2)将淡黄色溶液冷却到50℃，缓慢向淡黄色溶液中滴加含有氟化铵和氢氧化钠的甲醇溶液，在50℃继续搅拌反应25～35min，充分反应融合得到混合液Ⅰ；
[0015](1
‑
3)将混合液Ⅰ升温到80～90℃，蒸发除去甲醇，甲醇挥发期间溶液不断冒泡，再将混合液Ⅰ持续加热到120℃保温30min，直至溶液中不再有气泡产生，最后将混合液Ⅰ升温到300℃以上反应90min，然后自然冷却到室温得到混合液Ⅱ；
[0016](1
‑
4)将混合液Ⅱ转移到离心管中加入环己烷使其分散，离心得到沉淀，继续用环己烷重复上述步骤离心洗涤三次，最终得到稀土掺杂上转换纳米材料。
[0017]优选的，步骤(1
‑
1)中，油酸和十八烯的体积比为2：5；步骤(1
‑
2)中，每毫升甲醇溶液中溶有0.8mmol氟化铵和0.5mmol氢氧化钠，淡黄色溶液与含有氟化铵和氢氧化钠的甲醇溶液之间的体积比为(3～4):1；步骤(1
‑
4)中，离心参数为：转速为8000rpm/min，离心时间为5min。
[0018]进一步的，步骤(2)中，水溶性处理具体步骤：将稀土掺杂上转换纳米材料分散于环己烷溶液中形成上转换材料浓度为20mg/ml的混合溶液Ⅲ，再加入含有NOBF4的乙腈溶液进行搅拌反应得到水油分离的混合溶液Ⅳ，再将混合溶液Ⅳ离心后得到沉淀，沉淀再采用二甲基乙酰胺(DMF)溶液离心洗涤两次，最终得到的沉淀由DMF溶液分散即得到水溶性的稀土掺杂上转换纳米材料。
[0019]优选的，步骤(2)中，所述含有NOBF4的乙腈溶液中NOBF4的含量为10mg/ml，含有NOBF4的乙腈溶液与混合溶液Ⅲ的体积比为1:(0.9～1.1)。
[0020]优选的，步骤(2)中，搅拌反应参数为：搅拌速度为1000rpm/min，搅拌时间25～35min；离心参数为：离心速度为8000rpm/min，离心时间10～20min。
[0021]进一步的，步骤(3)中，羧基化蛋白包裹的具体步骤：
[0022](3
‑
1)将溶于超纯水中的牛血清白蛋白与过量乙二酸搅拌混合，接着利用碳酸氢钠将混合液液pH值调为7
‑
8，再加入EDC搅拌反应过夜；
[0023](3
‑
2)将步骤(3
‑
1)得到的蛋白液放入透析袋中，配制碳酸氢钠水溶液，将装有蛋白液的透析袋放入碳酸氢钠水溶液中，于3
‑
4℃下低温保存，每隔4
‑
6h更换碳酸氢钠水溶液，整个透析纯化至少72h，即得到羧基化牛血清白蛋白；
[0024](本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于稀土掺杂上转换纳米材料荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用热分解法制备稀土掺杂上转换纳米材料NaY1‑
x
‑
y
F4:Yb
x
Tm
y
，式中，x、y为Yb
3+
、Tm
3+
分别掺杂Y
3+
位的摩尔比，0.15≤x≤0.25，0.002≤y≤0.01，所述稀土掺杂上转换纳米材料的粒径为40
‑
50nm；(2)将步骤(1)得到的稀土掺杂上转化纳米材料进行水溶性处理得到水溶性的稀土掺杂上转换纳米材料；(3)对水溶性的稀土掺杂上转换纳米材料进行羧基化蛋白包裹得到表面含有羧基基团的稀土掺杂上转换纳米材料；(4)将表面含有羧基基团的稀土掺杂上转换纳米材料活化后与连接FAM的氨基化DNA探针相连得到具备荧光检测功能的荧光探针。2.根据权利要求1所述的一种基于稀土掺杂上转换纳米材料荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，热分解法具体步骤：(1
‑
1)将YCl3·
6H2O、YbCl3·
6H2O、TmCl3·
6H2O作为原料，按分子式NaY1‑
x
‑
y
F4：Yb
x
Tm
y
中各元素的化学计量比称取各原料，式中，x为Yb
3+
、Tm
3+
分别掺杂Y
3+
位的摩尔比，0.15≤x≤0.25，0.001≤y≤0.01，将上述各原料置于油酸和十八烯的混合溶液中，在惰性气体保护气的气氛下加热至160℃以上进行反应1h得到淡黄色溶液；(1
‑
2)将淡黄色溶液冷却到50℃，缓慢向淡黄色溶液中滴加含有氟化铵和氢氧化钠的甲醇溶液，在50℃继续搅拌反应25～35min，充分反应融合得到混合液Ⅰ；(1
‑
3)将混合液Ⅰ升温到80～90℃，蒸发除去甲醇，甲醇挥发期间溶液不断冒泡，再将混合液Ⅰ持续加热到120℃保温30min，直至溶液中不再有气泡产生，最后将混合液Ⅰ升温到300℃以上反应90min，然后自然冷却到室温得到混合液Ⅱ；(1
‑
4)将混合液Ⅱ转移到离心管中加入环己烷使其分散，离心得到沉淀，继续用环己烷重复上述步骤离心洗涤三次，最终得到稀土掺杂上转换纳米材料。3.根据权利要求2所述的一种基于稀土掺杂上转换纳米材料荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1
‑
1)中，油酸和十八烯的体积比为2：5；步骤(1
‑
2)中，每毫升甲醇溶液中溶有0.8mmol氟化铵和0.5mmol氢氧化钠，淡黄色溶液与含有氟化铵和氢氧化钠的甲醇溶液之间的体积比为(3～4):1；步骤(1
‑
4)中，离心参数为：转速为8000rpm/min，离心时间为5min。4.根据权利要求1或2所述的一种基于稀土掺杂上转换纳米材料荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，水溶性处理具体步骤：将稀土掺杂上转换纳米材料分散于环己烷溶液中形成上转换材料浓度为20mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶洪涛，丁洲，何跃，刘莹，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：