一种降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法技术

本发明专利技术公开了一种降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法，包括以下步骤：选择黄心夜合休眠期的顶芽作为外植体，进行预处理，将其浸泡于0.01g/L的PVP溶液且于4℃下暗处理4～5d后进行清洗；用酒精及NaClO溶液对预处理后的外植体进行消毒灭菌，得到黄心夜合无菌外植体；将无菌外植体接种到初代培养基上进行培养，初代培养基中添加了抗褐化剂PVP和VC；本发明专利技术通过对外植体取材、外植体预处理、灭菌处理、培养基中激素配比进行优化，将污染率与褐化率有效降低至4.17％和47.22％，解决了黄心夜合初代培养污染率、褐化率高的难题，且操作简单，成本低廉。成本低廉。成本低廉。

A primary culture method to reduce the pollution and browning of nocturnal explants of Xanthoceras

【技术实现步骤摘要】
一种降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法


[0001]本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及一种降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法。

技术介绍

[0002]黄心夜合(Michelia martinii)是木兰科含笑属植物，树干通直，树形丰满紧凑，叶色光亮，叶型秀丽，花芳香，淡黄色，秋季果熟，红艳夺目，可用于城市行道树或公园、庭院布置，也可提炼芳香油，具有观赏价值和用材价值。黄心夜合自然分布于我国河南南部、湖北西部、四川中部和南部、贵州、云南东北部。该种列入1999年8月4日批准的《国家重点保护野生植物名录(第一批)》：II级；列入《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》(IUCN) ——近危(NT)。
[0003]木兰科植物作为多心皮类植物的典型代表，是探索被子植物起源、发展演化和建立被子植物自然系统不可缺少的的关键材料；同时，木兰科植物是热带至温带常绿阔叶林和落叶阔叶林的重要组成成分，具有举足轻重的生态价值，又是园林观赏、工业用材、药材和香料树种，具有经济价值。然而，当前被广泛应用的木兰科植物仅限于木兰属、含笑属和木莲属中的小部分种类，相对于我国丰富的木兰科种质资源来说，开发利用程度仍然不够。
[0004]在自然条件下，木兰科植物由于雌雄异株，两性花但雄蕊早落或雌雄花花期不同等原因使得自然繁殖能力很差；种子繁殖中，有些种类的发芽率较低，有些种类分布地域狭窄、种子来源有限；常规无性繁殖中，扦插繁殖存在生根困难的问题，嫁接繁殖受嫁接方式及嫁接时间的影响，对操作人员技术要求较高。而组织培养与传统的繁殖方式相比，受季节和环境条件等因素的影响较小，具有繁殖速度快、繁殖系数大的优点，可以实现工厂化育苗，是木兰科植物资源开发与利用的有效途径。目前已有不少关于木兰科植物组织培养的报道，但还没有关于黄心夜合组织培养的研究。
[0005]在木兰科植物组培的过程中，污染与褐化现象普遍存在。外植体的褐化影响了多种木兰科植物芽体的萌发、愈伤组织的增殖与分化(苏梦云，姜景民.乐东拟单性木兰茎段愈伤组织诱导与褐变控制的研究[J].林业科学研究，2004(06)：757
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762.；刘均利，马明东.华盖木组织培养中褐化控制研究[J].浙江林业科技，2007(01)：20
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23+32.)，导致组培的效率不高，限制了组培苗大规模的生产(周丽艳，郭振清，秦子禹，苏孟立.白玉兰组织培养中的褐化控制[J].河北科技师范学院学报，2008，22(04)：19
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22.)。前期对于黄心夜合组织培养的预实验中发现，外植体存在严重的污染和褐化现象，阻碍了快繁体系的建立。
[0006]木兰科外植体的消毒多于生长季采用顶芽、茎段外植体，以0.1％的升汞溶液消毒。但是，升汞对于环境的污染大，废液难以回收处理。同时，汞离子在杀灭微生物的同时，也会对外植体造成伤害。消毒时间越长，外植体污染率越低，但是外植体褐化率升高。
[0007]目前一般认为植物组织培养中的褐化是酶促褐化，酶、底物和氧是酶促褐变的必要条件，酚类物质是外植体酶促褐变反应中的底物，多酚氧化酶(PPO) 是普遍认可的诱发褐化的酶。在正常的组织细胞内，酚类物质分布在液泡内， PPO分布在各种质体或细胞质
内，两者不接触。在建立外植体时，切口附近的细胞受到伤害，酚类与PPO的分隔被打破，两者接触，酚类物质在PPO的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，对外植体产生危害。前人通过外植体类型、采条季节的选择、外植体的预处理方式、添加抗氧化剂、暗培养等多种技术抑制褐化。
[0008]在利用黄心夜合组织进行离体培养时，如何在控制污染的同时抑制其褐化，以提升离体培养的成功率和效率，成为黄心夜合野生资源开发与利用过程中亟待解决的技术难题。

技术实现思路

[0009]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法。
[0010]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0011]一种降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法，包括以下步骤：
[0012](1)外植体的取材及预处理：于冬季12月～1月，选取黄心夜合当年生健康、无病害的半木质化带顶芽枝条，半木质化带顶芽枝条的基部用湿润的脱脂棉进行包裹，按自然生长的方向进行运输，经预处理后备用；
[0013]由于黄心夜合茎段污染与褐化严重，茎段外植体难以建立无菌体系，故本申请没有选择其他木兰科植物常用的茎段外植体，而是选择了黄心夜合处于休眠期的顶芽外植体。
[0014]外植体的预处理：将黄心夜合处于休眠期的顶芽外植体浸泡于0.01g/L的 PVP溶液且于4℃下暗处理4～5d后，先用自来水冲洗0.5h，再用毛笔蘸取洗洁净溶液轻轻刷一遍黄心夜合外植体的芽体表面，刷完后置于洗洁净溶液中浸泡5min，浸泡完再用自来水冲洗1～2h。
[0015](2)外植体的表面灭菌：用酒精及NaClO溶液对预处理后的外植体进行消毒灭菌，得到黄心夜合无菌外植体。
[0016]具体为：在超净工作台上，先用75％体积百分数酒精消毒25s，无菌水冲洗3～4遍，再用添加0.1wt.％吐温80的5wt.％NaClO溶液消毒12～14min，无菌水冲洗5～7遍对处理后的外植体进行消毒灭菌，在消毒灭菌过程中，使消毒灭菌液与外植体充分接触。
[0017](3)初代培养：将无菌外植体接种到初代培养基上进行培养，无菌外植体接种到初代培养基上进行培养前，去除无菌外植体外层鳞片，切除无菌外植体端部受伤部位，以口径为7cm的玻璃罐头瓶为培养容器，每瓶40mL～50mL 培养基。每瓶接种1个外植体，初代培养基为MS+0.5mg/L 6
‑
BA+0.1mg/L NAA+GA350mg/L+0.5g/L PVP+0.5g/L VC+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂；培养条件为：培养温度为24
±
1℃，光照时间为10～16h/d，光照强度为1 000～3 000lx。
[0018]进一步的，初代培养基在灭菌前将pH调到5.80，灭菌条件为121℃下20 min，PVP在高温灭菌前加入初代培养基，高温灭菌后，待初代培养基冷却至 60℃以下，将过滤灭菌的VC、GA3加入初代培养基。
[0019]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0020]1)本专利技术优化了黄心夜合组织培养初代培养阶段的操作方法，通过对外植体取
材、外植体预处理、灭菌处理、培养基中激素配比等途径进行优化，分别将污染率与褐化率有效降低至4.17％和47.22％，解决了黄心夜合初代培养污染率、褐化率高的难题，且操作简单，成本低廉。
[0021]2)本专利技术通过在灭菌处理前将黄心夜合处于休眠期的顶芽外植体浸泡于0.01g/n的PVP溶液且于4℃下暗处理4～5d，有效降低污染率与褐化率。
[0022]3)本专利技术采用适当浓度的次氯酸钠灭菌代替升汞，解决了升汞对环境有害，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法，其特征在于，包括以下步骤：选择半木质化带顶芽枝条作为黄心夜合外植体并进行预处理，将其浸泡于0.01g/L的PVP溶液且于4℃下暗处理4～5d后进行清洗；用酒精及NaClO溶液对预处理后的外植体进行消毒灭菌，得到黄心夜合无菌外植体；将无菌外植体接种到初代培养基上进行培养，所述初代培养基为MS+0.5mg/L 6
‑
BA+0.1mg/L NAA+GA
3 50mg/L+0.5g/L抗褐化剂+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂；所述抗褐化剂为PVP和VC，PVP和VC的浓度均为0.5g/L。2.根据权利要求1所述的降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法，其特征在于，于冬季12月～1月晴天的上午，采摘黄心夜合当年生健康、无病害的半木质化带顶芽枝条作为黄心夜合外植体。3.根据权利要求2所述的降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法，其特征在于，半木质化带顶芽枝条的基部用湿润的脱脂棉进行包裹，按自然生长的方向进行运输。4.根据权利要求1所述的降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法，其特征在于，黄心夜合外植体浸泡于0.1g/L的PVP溶液且于4℃下暗处理4～5d后，先用自来水冲洗0.5h，再用毛笔蘸取洗洁净溶液轻轻刷一遍黄心夜合外植体的芽体表面，刷完后置于洗洁净溶液中浸泡5min，浸泡完再用自来水冲洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿兴敏，宦智群，徐小蓉，乙引，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：