用便携式观察系统进行全身成像技术方案

介绍了用便携式仪器对完整受试体内的荧光蛋白进行成像的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
此专利技术涉及使用便携式仪器进行基于体内荧光蛋白的成像方法。用简单的外部成像技术观察受试体内具有荧光蛋白的细胞。配置后，这种便携式观察装置可筛选大量具有荧光蛋白的受试体。
技术介绍
全身成像技术已用于监测未受损身体内的“示踪分子”。例如，Brenner等人已在转移性恶性黑瘤病人身上对碘-123-2-羟基-3-碘-6-甲氧基-N-苯甲酰胺(IBZM)全身成像和铊-201闪烁扫描法的诊断价值进行过比较研究(Brenner，等人，Eur.J.Nucl.Med.，(1999)261567-1571)。Nucl.Med.，(1999)261567-1571).Benard等人对在全身PET(正电子放射断层扫描)成像中使用137铯进行衰减校正的处理技术进行了临床价值评估(Benard，等人，J.Nucl.Med.，(1999)401257-1263)。Jerusalem等人的研究表明在Hodgkin病和非Hodgkin淋巴瘤的治疗后评估中，18F-荧光脱氧葡萄糖的全身正电子放射X射线断层摄影术比传统的计算X线断层摄影成像技术具有更高的诊断和预知价值(Jerusalem，等人，Blood，(1999)94429-433)。Eustace等人讨论了全身MR(磁共振)成像的实际问题、临床应用及未来发展方向(Eustace，等人，Magn.Reson.Imaging Clin.(N.Am.)(1999)7209-236)。Engelson等人研究了脂肪在躯干肿大(用磁共振成像进行量化)的HIV感染者体内的分布情况，(Engelson，等人Am.J.Clin.Nutr.(1999)691162-1169)。Valk等人利用-荧光脱氧葡萄糖的全身正电子放射断层扫描(PET)来处理复发性结肠癌(Valk，等人，Arch.Surg.(1999)134503-511)。Saunders等人评估了-荧光脱氧葡萄糖全身正电子放射断层扫描(PET)成像在肺癌各时期中的作用(Saunders，等人，Ann.Thorac.Surg.(1999)67790-797)。这项很有价值的技术让人们可以形象地观察体内的基因表达、感染和瘤细胞转移，并且在了解遗传性后遗症的发展和研究改变其遗传征兆途径方面，该技术非常有用。与所述较为复杂的系统不同，该技术在其早期会伤害身体，它要求切除组织或用半透明材料制作皮下创口。近期，此技术已发展为用光放射来观察完整动物体内的肿瘤细胞或其它细胞的行为。例如，PCT公开的WO97/18841描述了如何用lux操纵子来改变Salmonella(沙门氏菌)，使这些感染源(infectious agent)发出荧光。无需外源荧光的激发，便可直接跟踪观察完整动物体内所发生的感染过程，但在观察期间，需对受试者进行固定，以便获得足够清晰的图象。因此，必须将动物固定在一个不透光的盒子里，图像由一个带电荷耦合元件的照相机生成，该照相机带有连接至Argus50图像处理器的两阶段微通道增强头。此方法需要使受试体保持不动，用光电探测装置来测量从受试体内部光源半分子处发射出的光子，直到发射出的光子生成图像为止，然后透过所述哺乳动物器官的不透明组织观察图像。要获得有用的图像，则需要采用复杂的技术。PCT出版物WO98/49336描述了用绿色荧光蛋白(GFP)做标记的转移模型。正如该出版物所描述的一样，GFP常用来标记荧光蛋白，这些荧光蛋白不仅可以发出绿色荧光，也可以发出许多其它颜色的荧光。无需固定受试体，就可以对植入肿瘤的转移情况进行实时观察，因为这种蛋白能发射出非常强的荧光。在这种情况下，用荧光显微法观察完整动物体内的状况，同样要求采用相当复杂的技术。随后的PCT出版物WO00/40274介绍了类似的技术。这些技术延伸到用绿色荧光蛋白对基因表达(在WO 01/71009中)和感染进程(在WO2004/016766中)进行观察。Yang等人在所发表的Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(2000)971206-1211中，对这些成果进行了详细说明，文中展示了肿瘤在活小鼠体内的生长和转移的实时荧光照片。全身光学成像系统利用外部光源，对受试体不会造成伤害。它以前所未有的方式提供了对完整动物体内的恶性生长和扩散的连续性可视监测。Yang等人已构造了能稳定并以高水平表达Aequoreavictoria绿色荧光蛋白(GFP)的人类和啮齿动物肿瘤，并且已将这些肿瘤移植到合适的动物体内。全身光学成像系统可显示原发结肠肿瘤及其在肝脏和骨骼内转移瘤的实时生长情况。成像可使用透视性外荧光显微镜，或者荧光盒及热电制冷色电荷耦合元件照相机。转移和微转移的成像程度视其大小而定。然而，用于观察的仪器也是相当复杂的。为获得高倍放大的图像，可使用Leica荧光立体显微镜，LZ12型(配有50瓦的汞灯)。使用D425/60带通滤光器和470DCXR分色镜就实现有选择地激发GFP。发射的荧光通过位于HamamatsuC5810-3-芯片制冷色电荷耦合元件照相机(Hamamatsu Photonics Systems，Bridgewater，NJ)上的长通滤光器GG475收集(Chroma Technology，Brattleboro，VT)。对图像进行对比度和亮度处理，并用IMAGE PRO PLUS 3.1软件进行分析(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)。1,024×724像素的图像可直接由IBMPC捕获，或通过SLV-R-1000型号的高清晰度Sony VCR(Sony，Tokyo)上的视频输出连续捕获。整个动物的较小放大倍数的成像过程在由蓝色光纤(Lightools Research，Encinitas，CA)照明的光盒里进行，利用上面提到的热电制冷色电荷耦合元件照相机生成图像。此外，对GFP荧光强度进行测量，以记录不同时间内各成像区域激发亮度的变化。通过将小鼠表皮上天然的红色荧光作为基准来矫正这些因素，可矫正GFP所造成的内在绿色荧光的增加量。此方法可行是由于GFP光中红光量相对较少。因此，以表皮图像中红光和绿光的通道构成作为基础，并以相对红光来计算绿色荧光。计算出皮肤图像中无和有GFP时各像素的绿光与红光的通道比率(γ)。在没有GFP存在的情况下，整个小鼠表皮图像的γ值相当稳定，在0.7-1.0之间变化。当动物体内有GFP荧光时，相对于红光，绿光的成份有所增加，这表现在较高的γ值上。将像素数目与每个γ值大于1的像素相乘，计算出GFP荧光总量的近似值。这个乘积大致对应于无GFP的皮肤最大γ值之上的总体GFP荧光。在没有GFP存在时，小鼠表皮图像中γ值大于1的像素数小于0.02％；并且该数量随GFP的表达而增加。在附图说明图1A和1B中，以病毒注入大脑和肝脏后的时间函数分别表示的值。将从完好的动物活体获得的各器官的高倍放大图像与死亡并解剖后立即进行直接观察的类似器官进行比较。图片显示了基因表达在各种器官中的分布情况。无一例外的是，这些从外部获取的图像与那些在裸露器官上所观察到的景象相类似。将活体动物置于光盒中观察，同样可监测到基因表达，这样便可对活体动物及动物体内发生的表达进行实时观察。例如，用光盒对裸露小鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种透过完整受试体的皮肤显现荧光蛋白的方法，该方法包括用附带有第一滤光器的便携式光源用激发光施加至所述受试体；通过第二滤光器观察所述蛋白发射的光线。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨萌，姜平，
申请(专利权)人：抗癌公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]