多种具有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用制造技术

本发明专利技术提供多种去甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸及应用。本发明专利技术共设计了多种不同类型的CpG寡聚脱氧核苷酸序列，并对这些序列进行修饰，修饰包括但不限于硫代、甲氧基、氟、纳米粒子或其它修饰；这些序列能有效激活人体或动物免疫系统，具有广谱预防和治疗病原微生物感染包括但不限于病毒、细菌、真菌、寄生虫导致的疾病的功能；具有作为人或动物抗感染性疫苗佐剂的功能；具有广谱单药治疗恶性肿瘤，作为肿瘤治疗联合用药及作为肿瘤疫苗佐剂的功能；可以通过系统性或局部给药达到治疗疾病的目的。系统性或局部给药达到治疗疾病的目的。系统性或局部给药达到治疗疾病的目的。

【技术实现步骤摘要】
多种具有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及多种CpG寡聚脱氧核苷酸及用途。

技术介绍

[0002]先天免疫系统是人体或哺乳动物检测和抵抗病毒、细菌、寄生虫、毒素等入侵或感知创伤的第一道防线。人体的先天免疫系统由体表屏障、鼻黏膜的纤毛粘液及表达众多Toll样受体的免疫细胞组成。目前人体中发现的Toll样受体有11个，微生物进入人体后，可触发单个或数个Toll样受体而激发先天免疫系统，进而产生大量的I型干扰素及激活NK细胞等先天免疫细胞，达到清除病原微生物的目的。
[0003]TLR
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9为最重要的Toll样受体之一，其配体是去甲基化的病毒或细菌的含有CpG的DNA片段。病毒或细菌的CPG片段进入细胞的内体，和TLR
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9结合后激活的一系列信号传递会产生大量的I型干扰素、募集NK细胞、树突样细胞及其他相关的免疫反应。
[0004]CpG 寡聚脱氧核苷酸（oligodeoxyribonucleotides，ODN）可直接激活浆细胞样树突状细胞、B细胞、NK细胞等细胞。由此产生的免疫反应的特征在于产生促炎和Th1细胞因子以及多反应性免疫球蛋白。这种先天免疫反应为抗原特异性适应性免疫奠定了基础。因此免疫刺激寡核苷酸可用于治疗、预防或改善免疫系统缺陷（例如，肿瘤或癌症或病毒、真菌、细菌或寄生虫感染）引起的疾病。
[0005]通过改善抗原呈递细胞的功能，CpG ODN有助于体液和细胞疫苗特异性免疫应答的产生。临床前研究表明，当全身或粘膜给药时， CpG ODN可显著提高免疫反应，从而提高传染病疫苗、癌症疫苗的活性。临床试验表明，CpG ODN具有良好的安全性，并增加了共用疫苗的免疫原性。
[0006]健康情况下，机体的免疫系统可监视机体因基因突变形成的恶性病变细胞并将其杀灭。但在免疫系统功能低下的情况下，恶性细胞迅速增长。免疫力提高后可有效杀灭和抑制肿瘤细胞的生长。免疫检查点抑制剂如抗PD1或PDL
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1抗体可以显著提高免疫反应，杀灭和抑制肿瘤的生长，已被批准治疗多种肿瘤，大大延长了患者的存活期，已经成为肿瘤治疗的基础疗法。但由于大部分肿瘤患者对抗PD1或PDL
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1抗体治疗响应率只有15
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30%。因此PD1疗法和其他有效治疗肿瘤药物的联用成为了肿瘤治疗的趋势。其中CPG ODN可有效刺激先天免疫（I/II/III型干扰素）及Th1的免疫反应，是和PD1疗法联用的良好药物。已有证据表明CPG ODN和PD1药物联用可显著提高疗效。
[0007]SARS
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CoV
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2感染在2019年12月爆发，肆虐全球，至2022年初，已造成600多万人的死亡。从2019年的原始毒株开始，SARS
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Cov
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2经历了alpha, beta, delta和omicron毒株的演变，传染性越来越强，传染率从最初alpha的RO为2到omicron的RO为10。现有研究表明，SARS
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cov
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2越来越强的传染力和它基因组里越来越少的CpG含量有关。人体中锌指抗病毒蛋白（zinc finger antiviral protein，ZAP）是先天免疫的一个重要机制：它可识别并特异性结合病毒的CpG二核苷酸并招募其他蛋白质来降解病毒RNA基因组。而SARS
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CoV
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2通过一系列突变，减少了基因组中CpG的数量，使其能逃逸机体先天免疫系统的识别和降解。此
外，SARS
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Cov
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2也产生一些物质抑制I型干扰素的激活，使其逃逸先天免疫系统的攻击。因此当人体暴露在存在SARS
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CoV
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2感染风险的环境中时，通过体外补充含有CpG的ODN，将有希望恢复人体对SARS
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CoV
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2的免疫反应，进而减少感染风险。
[0008]很多病毒或其他病原微生物感染人类时，往往从上呼吸道和鼻粘膜开始，在局部大量繁殖后下行到下呼吸道和肺部，引起肺炎。如SARS
‑
Cov
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2进入鼻腔黏膜后，和黏膜上皮的纤毛细胞表达的ACE2受体结合然后进入细胞，利用宿主细胞大量繁殖病毒。当黏膜先天免疫力强时，强大的I型干扰素可直接杀灭和抑制病毒的繁殖，将病毒局限在上呼吸道并减少病毒颗粒，防止了病毒的下行和肺部感染（肺炎）的发生，同时减少了人群间的传播。当鼻黏膜免疫力低下时，病毒将快速繁殖并下行到肺部引起肺炎，同时产生大量病毒颗粒，引起人群间的传播。
[0009]如在SARS
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Cov
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2感染前或感染后初期从鼻腔黏膜喷入含CPG的寡聚核苷酸，可刺激鼻腔黏膜的免疫系统（Nose associated lymphoid tissue, NALT）产生强大的先天免疫（I/II/III型干扰素的产生）和Th1免疫反应（DC，NK和CD8T细胞的激活，IL
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12的产生），将病毒抑制或杀灭，使感染局限于上呼吸道，无法下行到肺部引发肺炎。
[0010]现有临床前研究表明将CpG ODN应用于呼吸道感染性疾病的预防和治疗是一个非常有效的策略。因此，亟需临床开发具备阻断呼吸道病毒感染和传播的新型CpG ODN。此外，目前CpG ODN作为人或动物疫苗佐剂的应用仍很有限，因此，需要研发更多安全、高效的CpG ODN疫苗佐剂。

技术实现思路

[0011]为解决上述问题，本专利技术公开了多种具有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用。
[0012]为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：理性设计并通过固相合成法制备了多条不同类型的CpG序列，然后利用离子交换色谱、反相色谱或电泳等方法进行纯化分离，得到纯化产物，再使用超滤设备将纯化产物脱盐和浓缩，通过冻干，得到白色、类白色至淡黄色疏松终产品。然后通过人淋巴瘤细胞、动物脾细胞、动物PBMC、人PBMC评估各个CpG ODN的免疫刺激活性。具体来说，基于Namalwa细胞检测各个CpG ODN对IL
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6、TNF
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α等细胞因子释放的刺激作用；基于NK
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92细胞检测CpG ODN对IFN
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γ等分泌的影响；基于动物脾细胞、动物或人PBMC检测各个CpG ODN对IFN
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α、IFN
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γ、IL
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6、TNF
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α等细胞因子释放的刺激作用；基于Namalwa细胞检测各个CpG ODN对其促增殖作用；基于动物脾细胞、动物或人PBMC检测各个CpG ODN对B细胞等免疫细胞的促增殖作用；基于TLR9/NFkB
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Luc/HEK293细胞检测CpG ODN对TLR9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.含有未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤的免疫刺激性寡聚核苷酸，大小在10 到 50个碱基之间，该寡聚核苷酸由未经修饰或经过修饰的核苷酸单体组成，修饰类型包括硫代修饰、甲氧基修饰、氟修饰或纳米粒子修饰，纳米粒子修饰包括PLGA，壳聚糖和脂质体。2.CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列为以下八个C型CpG寡聚脱氧核苷酸中的任一个或序列中含有以下八个中的任一个：5
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。3.根据权利要求2所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有硫代修饰。4.根据权利要求2所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有氟代修饰。5.根据权利要求2所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有甲氧基修饰。6.根据权利要求2所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有纳米粒子修饰，纳米粒子包括PLGA、壳聚糖、脂质体。7.CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列为以下六个B型CpG寡聚脱氧核苷酸中的任一个或序列中含有以下六个中的任一个：5
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，潘奇，茆辉，
申请(专利权)人：南京吉盛澳玛生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：