用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPRCas-SDA-AuNPs的细菌检测方法技术

本发明专利技术属于细菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas

【技术实现步骤摘要】
用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPRCas
‑
SDA
‑
AuNPs的细菌检测方法


[0001]本专利技术属于细菌检测
，具体涉及一种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas
‑
SDA
‑
AuNPs的细菌检测方法。

技术介绍

[0002]细菌是引起许多疾病的重要病原体。快速、准确的细菌检测可以实现突发传染病病原体的早期诊断；可指导临床合理用药，减少因病原不明或经验性用药导致的日益严峻的耐药性问题。然而，当前传统的细菌检测技术如细菌培养方法非常耗时，聚合酶链式反应（PCR）或酶联免疫吸附试验（ELISA）依赖于昂贵的仪器设备和熟练的操作人员，无法满足医疗条件落后国家和地区的检测需求，也限制了它们在即时检测中的广泛应用。
[0003]基于纳米材料的即时检测方法在快速、灵敏和特异性的细菌检测方面引起了人们的兴趣。金纳米颗粒（AuNPs）是合成历史最悠久且应用领域最为广泛的纳米材料之一，具有与尺寸相关的光学特性，可以表现出一系列的颜色性质，分散的AuNPs在可见光范围内表现出典型的等离子体吸收。当发生聚集时，其吸收峰值红移，颜色由红色变为蓝色。由于这一特性，基于AuNPs的细菌比色检测法已被广泛应用于食品安全、疾病诊断等检测领域。该方法可以通过肉眼直观判断颜色变化，实现对目标物的定性或半定量检测。但为了实现其定量测量，往往需要借助于分光光度计等大型仪器，不适用于现场快速检测。
[0004]此外，现有的高灵敏核酸检测技术通常使用核酸扩增技术来进行信号放大，以进一步提高检测的灵敏度。链置换等温扩增反应（strand displacement amplification，简称为SDA）是一种基于限制性核酸内切酶和DNA聚合酶催化的连续切割和聚合/置换过程的酶促DNA体外等温扩增方法，具有效率高、特异性高、设备要求低等优点，尽管在核酸分析方面表现出明显的优势，但SDA无法直接用于细菌基因组的检测，往往需要与适体特异性结合。受制于高特异性适体的筛选，目前基于适体的SDA细菌检测方法往往存在特异性不高的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas
‑
SDA
‑
AuNPs的细菌检测方法。
[0006]本专利技术的第一方面，提供一种用于检测细菌的试剂盒，包括SDA体系、CRISPR/Cas体系和DNA
‑
AuNPs；所述SDA体系包括Template、Primer、Bst3.0 DNA聚合酶、Nt.BbvCI切刻内切酶、dNTPs；所述CRISPR/Cas体系包括Cas12a和crRNA，所述Cas12a和crRNA可识别细菌基因组并在识别出含有目标细菌基因组后可非特异性切割Template；所述DNA
‑
AuNPs上的DNA与SDA体系中Template和Primer在Bst3.0 DNA聚合酶和
Nt.BbvCI内切酶作用下经过链置换等温扩增后产生的ssDNA链两端互补。
[0007]优选的，所述DNA
‑
AuNPs为SH
‑
DNA1和SH
‑
DNA2与AuNPs混合孵育得到；SH
‑
DNA1序列为5
’‑ꢀ
TTG TCG TTG CGT GCT GA
‑
SH
‑3’
；SH
‑
DNA2序列为5
’‑ꢀ
SH
‑
CCC AGG TTC TCT
ꢀ‑3’
；Template序列为5
’‑ꢀ
CCC AGG TTC TCT TTG TCG TTG CGT GCT GAG GTT AGC AAA GTA GCG TG
‑3’
；Primer序列为5
’‑ꢀ
CAC GCT ACT TTG CTA A
‑3’
；crRNA序列为5
’‑ꢀ
UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU GGG CCU AGA UAA AGA AGA AC
‑3’
。
[0008]优选的，所述DNA
‑
AuNPs为SH
‑
DNA1和SH
‑
DNA2与AuNPs混合后于36
‑
38℃振荡孵育10
‑
50分钟，然后加入柠檬酸/盐酸缓冲液，震荡孵育振荡孵育8
‑
12小时。
[0009]优选的，柠檬酸/盐酸缓冲液孵育时间为10小时。
[0010]优选的，所述DNA和AuNPs的最佳比例为200：1。
[0011]本专利技术的第二方面，提供一种基于CRISPR/Cas
‑
SDA
‑
AuNPs的细菌检测方法，所述方法为非疾病诊断或治疗应用，其采用如权利要求1
‑
5任一项所述的用于检测细菌的试剂盒；所述方法包括以下步骤：（1）采用CRISPR/Cas体系与待测试样进行酶切反应，得到酶切反应液；（2）采用SDA体系对步骤（1）得到的酶切反应液进行扩增得到SDA扩增产物；（3）将SDA扩增产物与DNA
‑
AuNPs混合进行反应。
[0012]优选的，步骤（1）中酶切反应得到的酶切反应液先通过升温孵育进行Cas酶活性灭活，灭活后进行杂交反应使灭活过程中打开的杂交双链重新恢复为杂交双链，然后在步骤（2）中采用SDA体系进行扩增。
[0013]优选的，步骤（2）中所得到的SDA扩增产物通过升温孵育进行酶失活。
[0014]优选的，步骤（3）反应后，通过光热检测，当存在创伤弧菌时，经过660 nm激光照射后，温度上升。
[0015]优选的，步骤（3）反应后，通过UV
‑
vis检测，所述细菌为创伤弧菌，所述细菌浓度与步骤（3）得到的反应液于530 nm处吸光度值呈正比。
[0016]本专利技术的有益效果如下：本专利技术引入CRISPR
‑
Cas系统（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat and CRISPR
‑
Associated Protein），通过CRISPR/Cas12a特异性识别细菌和SDA进行检测信号放大，提出了基于CRISPR/Cas12a
‑
SDA和DNA
‑
AuNPs光热效应的细菌检测方法，可以实现对细菌的简便、快速、高灵敏检测。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测细菌的试剂盒，其特征在于：包括SDA体系、CRISPR/Cas体系和DNA
‑
AuNPs；所述SDA体系包括Template、Primer、Bst3.0 DNA聚合酶、Nt.BbvCI切刻内切酶、dNTPs；所述CRISPR/Cas体系包括Cas12a和crRNA，所述Cas12a和crRNA可识别细菌基因组并在识别出含有目标细菌基因组后可非特异性切割Template；所述DNA
‑
AuNPs上的DNA与SDA体系中Template和Primer在Bst3.0 DNA聚合酶和Nt.BbvCI内切酶作用下经过链置换等温扩增后产生的ssDNA链两端互补。2.根据权利要求1所述的用于检测细菌的试剂盒，其特征在于：所述DNA
‑
AuNPs为SH
‑
DNA1和SH
‑
DNA2与AuNPs混合孵育得到；SH
‑
DNA1序列为5
’‑ꢀ
TTG TCG TTG CGT GCT GA
‑
SH
‑3’
；SH
‑
DNA2序列为5
’‑ꢀ
SH
‑
CCC AGG TTC TCT
ꢀ‑3’
；Template序列为5
’‑ꢀ
CCC AGG TTC TCT TTG TCG TTG CGT GCT GAG GTT AGC AAA GTA GCG TG
‑3’
；Primer序列为5
’‑ꢀ
CAC GCT ACT TTG CTA A
‑3’
；crRNA序列为5
’‑ꢀ
UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU GGG CCU AGA UAA AGA AGA AC
‑3’
。3.根据权利要求2所述的用于检测细菌的试剂盒，其特征在于：所述DNA
‑
AuNPs为SH
‑
DNA1和SH
‑
DNA2与AuNPs混合后于36
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙文悦，董雯佳，郑潮钏，郑来宝，楼永良，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：