几丁质酶突变体及应用制造技术

本发明专利技术属于蛋白质工程改造领域，具体涉及几丁质酶突变体及应用。本发明专利技术通过对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）来源的几丁质酶进行改造，其相对于原始氨基酸序列，将其第293位氨基酸由Asn变为Trp，且第299位氨基酸由Ala变为Arg，并构建该突变体的地衣芽胞杆菌表达菌株。所构得的地衣芽胞杆菌工程菌株的几丁质酶活力达到144.63 U/mL，相比原始几丁质酶表达菌株提高了31％。酶表达菌株提高了31％。

Chitinase mutant and its application

【技术实现步骤摘要】
几丁质酶突变体及应用


[0001]本专利技术属于蛋白质工程改造领域，具体涉及几丁质酶突变体及应用。

技术介绍

[0002]几丁质又名甲壳素，是由β
‑
(1
‑
4)
‑2‑
乙酰氨基
‑2‑
脱氧
‑
D
‑
葡萄糖(GlcNAc)通过β
‑
1，4糖苷键连接形成的高分子碳水化合物，这些化合物和一些蛋白质、酚类、脂类或其他碳水化合物，如β
‑
葡聚糖等交联形成高度有序的高分子支架，构成虾壳、蟹壳、昆虫外壳及真菌细胞壁，在自然界含量非常丰富，仅次于纤维素和半纤维素。几丁质分子间和分子内可形成大量的氢键，致使结构紧密，难溶于水。几丁质和壳聚糖作为一类可再生资源，在食品、化工、医药和农业等领域有广泛的应用前景，如几丁质或壳聚糖可用于手术缝合线、药物递呈载体、染料吸附剂、重金属吸附剂等。几丁质和壳聚糖进一步的降解产物几丁寡糖、壳寡糖不仅具有几丁质和壳聚糖的某些生物学功能，如植物生长发育调节、吸附螯合重金属等，而且具有自身特殊的性质，如水溶性、抗菌抑菌作用、减肥与降低胆固醇及抗肿瘤活性等功能。
[0003]几丁质酶(chitinase，EC3.2.1.14)是一种能专一性地催化GlcNAc
‑
GlcNAc或GlcNAc
‑
GlcNC糖苷键断裂，从而使几丁质降解成为几丁寡糖或单糖的一类酶的总称，在自然界的碳、氮素循环，微生物侵染植物组织、机体免疫、生物防御等方面起了重要作用，广泛分布于微生物、植物、脊椎动物及昆虫中。与其它来源的几丁质酶相比，微生物几丁质酶具有种类多、活力高、性质多样等优点，
[0004]酶分子的定向进化，是模拟自然进化过程的人工策略，属于蛋白质的非理性设计方式，通过利用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，迅速获得理想的突变体。近几年酶的定向进化主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特异性、提高热稳定性、对映立体选择等方面(Johannes TW et al.Curr.Microbiol,2006,9:261
‑
267)。酶的定向进化技术为酶的结构和功能开辟了崭新的途径，在工业、农业、食品业、环境等领域取得巨大成功。
[0005]由于几丁质结晶度高，使得几丁质酶与底物(几丁质)无法充分接触，使得目前几丁质酶比活力普遍较低。目前，许多微生物能够分泌一定量的几丁质酶，但是普遍存在分泌量不足、活性不高等问题。重组蛋白技术是直接获取大量高纯度几丁质酶的重要技术手段。与其他外源基因表达系统相比，微生物表达系统因生长快、培养周期短、成本低廉等特点在蛋白表达技术中应用广泛。其中,芽胞杆菌被证明是优良的蛋白表达宿主，能够用于外源蛋白的高效生产。与其他表达系统相比，芽胞杆菌具有多种优点，包括无毒、基因修饰方便、营养廉价、发酵周期短、蛋白质能力强、工业发酵中的分泌和稳健性等。然而，目前异源表达几丁质酶的酶活依然较低，影响了几丁质酶的应用推广。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供了一种几丁质酶突变体BL10/chiA299，其蛋白为SEQ ID NO.4所示。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供了几丁质酶突变体BL10/chiA293
‑
299，其蛋白为SEQ ID NO.6所示。
[0008]本专利技术的另一个目的在于提供了几丁质酶突变体的应用。本专利技术获得的几丁质酶突变体能在温和条件下能提高酶活，有望提高制备几丁寡糖的反应效率，降低生产成本。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0010]在原始几丁质酶ChiA氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的基础上，将其第293位氨基酸由Asn变为Trp，突变体命名为ChiA
‑
293，蛋白为SEQ ID NO.3所示；将第299位氨基酸由Ala变为Arg，突变体命名为ChiA
‑
299，蛋白为SEQ ID NO.4所示；将第293位氨基酸由Asn变为Trp，且将第299位氨基酸由Ala变为Arg，突变体命名为ChiA
‑
293
‑
299，蛋白为SEQ ID NO.6所示。
[0011]携带有SEQID NO.4或SEQ ID NO.6突变体的编码基因的重组表达载体，属于本专利技术的保护范围。
[0012]表达SEQID NO.4或SEQ ID NO.6突变体的重组地衣芽胞杆菌，也属于本专利技术的保护范围。现有技术中用于表达外源蛋白的地衣芽胞杆菌均可用于本专利技术。
[0013]所述的地衣芽胞杆菌优选的为地衣芽胞杆菌BL10。
[0014]上述的重组表达载体或重组地衣芽胞杆菌用于制备几丁质酶也属于本专利技术的保护范围。
[0015]本专利技术的保护范围还包括：SEQID NO.4或SEQ ID NO.6突变体在降解几丁质中的应用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0017]本专利技术以来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶ChiA为基础，通过定点突变技术获得了两个几丁质酶突变体BL10/chiA293和BL10/chiA299，并在地衣芽孢杆菌中对上述突变体进行了发酵，其发酵上清液酶活分别为121.28U/mL和130.36U/mL，比原始几丁质酶的地衣芽孢杆菌酶活BL10/pHY
‑
chiA(113.04U/mL)分别提高了8％和17％，再将这两个突变位点进行叠加组合得到几丁质酶突变体BL10/chiA293
‑
299,其发酵上清液酶活可达到144.63U/mL，比原始几丁质酶表达菌株BL10/pHY
‑
chiA(113.04U/mL)提高了31％。
附图说明
[0018]图1为几丁质酶表达载体的质粒图谱。
[0019]图2为几丁质酶单突变体的相对酶活图。
[0020]图3为几丁质酶突变体的相对酶活图。
具体实施方式
[0021]以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本专利技术中涉及到的实验材料和试剂：
[0022]对于本专利技术所涉及的术语及相关测定方法解释如下：
[0023]几丁质酶活性测定所用试剂
[0024]1.定义：在37℃，pH6.0时，通过β
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖苷酶辅助的两步反应，每分钟
催化生成1mg N
‑
乙酰葡萄糖的几丁质酶量为一个活力单位，单位为U。
[0025]2.胶体几丁质的制备
[0026]a)准确称取2g粉末几丁质，加入预冷的45mL浓盐酸后并在磁力搅拌器上搅拌2h，此时粉末几丁质完全溶解成黄色。放入冰箱4℃，静置本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种几丁质酶突变体，所述突变体为SEQ ID NO.4所示。2.一种几丁质酶突变体，所述突变体为SEQ ID NO.6所示。3.携带有SEQID NO.4或SEQ ID NO.6突变体的编码基因的重组表达载体。4.表达SEQID NO.4或SEQ ID NO.6突变体的重组地衣芽胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，雷波，蔡冬波，廖永庆，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：