CAS12A核酸酶的变体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及具有改变的前间隔子邻近基序识别特异性的Cas12a核酸酶的变体。本发明专利技术还涉及制备CRISPR

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CAS12A核酸酶的变体及其制备方法和用途
[0001]关于以电子方式提交序列表的声明
[0002]提供了ASCII文本格式的序列表以代替纸质副本，该序列表遵照37C.F.R.
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1.821之规定递交，文件名为1499.7WO_ST25.txt，大小为257,774字节，于2020年10月13日生成并经由EFS
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Web提交。该序列表特此通过引用方式于此处并入本说明书中，用于公开其内容。
[0003]优先权声明
[0004]本申请要求根据35U.S.C.
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119(e)于2019年10月17日提交的第62/916,392号美国临时申请的权益，该临时申请的全部内容通过引用方式并入本文。


[0005]本专利技术涉及具有改变的前间隔子邻近基序识别特异性的Cas12aCRISPR
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Cas核酸酶的变体。本专利技术还涉及制备CRISPR
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CAS核酸酶变体的方法和使用所述变体修饰核酸的方法。

技术介绍

[0006]基因组编辑/修饰是利本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种经修饰的毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌CRISPR(簇状规律间隔性短回文重复序列)Cas12a(LbCas12a)多肽，其中所述经修饰的LbCas12a多肽包含以下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列(LbCas12a)具有至少80％同一性，并且参照SEQ ID NO:1的位置编号，具有位于以下位置K116、K120、K121、D122、E125、T148、T149、T152、D156、E159、Q529、D535、K538、D541、Y542、L585、K591、M592、K595、V596、S599、K600、K601、Y616、Y646、W649中一个或多个处的突变，任选地，参照SEQ ID NO:1的位置编号，具有位于以下位置K116、K120、K121、D122、E125、T152、D156、E159、G532、D535、K538、D541和/或K595中一个或多个处的突变。2.权利要求1所述的经修饰的LbCas12a多肽，其中参照SEQ ID NO:1的位置编号，所述经修饰的LbCas12a多肽包含下列氨基酸突变中的一种或多种：K116R、K116N、K120R、K120H、K120N、K120T、K120Y、K120Q、K121S、K121T、K121H、K121R、K121G、K121D、K121Q、D122R、D122K、D122H、D122E、D122N、E125R、E125K、E125Q、E125Y、T148H、T148S、T148A、T148C、T149A、T149C、T149S、T149G、T149H、T149P、T149F、T149N、T149D、T149V、T152R、T152K、T152W、T152Y、T152H、T152Q、T152E、T152L、T152F、D156R、D156K、D156Y、D156W、D156Q、D156H、D156I、D156V、D156L、D156E、E159K、E159R、E159H、E159Y、E159Q、Q529N、Q529T、Q529H、Q529A、Q529F、Q529G、Q529G、Q529S、Q529P、Q529W、Q529D、G532D、G532N、G532S、G532H、G532F、G532K、G532R、G532Q、G532A、G532L、G532C、D535N、D535H、D535V、D535T、D535S、D535A、D535W、D535K、K538R、K538V、K538Q、K538W、K538Y、K538F、K538H、K538L、K538M、K538C、K538G、K538A、K538P、D541N、D541H、D541R、D541K、D541Y、D541I、D541A、D541S、D541E、Y542R、Y542K、Y542H、Y542Q、Y542F、Y542L、Y542M、Y542P、Y542V、Y542N、Y542T、L585G、L585H、L585F、K591W、K591F、K591Y、K591H、K591R、K591S、K591A、K591G、K591P、M592R、M592K、M592Q、M592E、M592A、K595R、K595Q、K595Y、K595L、K595W、K595H、K595E、K595S、K595D、K595M、V596T、V596H、V596G、V596A、S599G、S599H、S599N、S599D、K600R、K600H、K600G、K601R、K601H、K601Q、K601T、Y616K、Y616R、Y616E、Y616F、Y616H、Y646R、Y646E、Y646K、Y646H、Y646Q、Y646W、Y646N、W649H、W649K、W649Y、W649R、W649E、W649S、W649V和/或W649T，任选地，参照SEQ ID NO:1的位置编号，包含下列氨基酸突变中的一种或多种：K116R、K116N、K120Y、K121S、K121R、D122H、D122N、E125K、T152R、T152K、T152Y、T152Q、T152E、T152F、D156R、D156W、D156Q、D156H、D156I、D156V、D156L、D156E、E159K、E159R、G532N、G532S、G532H、G532K、G532R、G532L、D535N、D535H、D535T、D535S、D535A、D535W、K538R、K538V、K538Q、K538W、K538Y、K538F、K538H、K538L、K538M、K538C、K538G、K538A、D541E、K595R、K595Q、K595Y、K595W、K595H、K595S和/或K595M。3.权利要求1或权利要求2所述的经修饰的LbCas12a多肽，其中所述经修饰的LbCas12a多肽具有改变的PAM(前间隔子邻近基序)特异性。4.权利要求1或权利要求2所述的经修饰的LbCas12a多肽，其还包含核酸酶活性位点(例如，RuvC结构域)中的突变(例如，失活LbCas12a，dLbCas12a)。5.一种融合蛋白，其包含权利要求1至4中任一项所述的经修饰的LbCas12a多肽以及接头，任选为肽接头。6.权利要求5所述的融合蛋白，其中所述肽接头连接至所述经修饰的LbCas12a多肽的C
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末端和/或N
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末端。
7.一种融合蛋白，其包含权利要求1至4中任一项所述的经修饰的LbCas12a多肽以及感兴趣的多肽。8.权利要求7所述的融合蛋白，其中所述感兴趣的多肽连接至所述经修饰的LbCas12a多肽。9.权利要求7或权利要求8所述的融合蛋白，其中所述感兴趣的多肽连接至所述经修饰的LbCas12a多肽的C
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末端和/或N
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末端。10.权利要求7至9中任一项所述的融合蛋白，其中所述感兴趣的多肽经由接头，任选地经由肽接头，连接至所述经修饰的LbCas12a多肽。11.权利要求7至9中任一项所述的融合蛋白，其中所述感兴趣的多肽包含至少一种具有下列活性的多肽或蛋白结构域：脱氨酶(脱氨基)活性、切口酶活性、重组酶活性、转座酶活性、甲基化酶活性、糖基化酶(DNA糖基化酶)活性、糖基化酶抑制剂活性(例如，尿嘧啶
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DNA糖基化酶抑制剂(UGI))、去甲基化酶活性、转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸酶活性、单链RNA切割活性、双链RNA切割活性、限制性内切核酸酶活性(例如，Fok1)、核酸结合活性、甲基转移酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性和/或光裂合酶活性。12.权利要求7至11中任一项所述的融合蛋白，其中所述感兴趣的多肽包含至少一种具有脱氨酶活性的多肽或蛋白结构域。13.权利要求12所述的融合蛋白，其中所述至少一种具有脱氨酶活性的多肽或蛋白结构域是胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域。14.权利要求13所述的融合蛋白，其中所述胞嘧啶脱氨酶结构域是载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样(APOBEC)结构域。15.权利要求13所述的融合蛋白，其中所述腺嘌呤脱氨酶结构域是TadA(tRNA特异性腺苷脱氨酶)和/或TadA*(进化的tRNA特异性腺苷脱氨酶)。16.权利要求7至14中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一种多肽具有糖基化酶抑制剂活性，任选地，其中所述至少一种多肽是尿嘧啶
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DNA糖基化酶抑制剂(UGI)。17.一种多核苷酸，其编码权利要求1至4中任一项所述的经修饰的LbCas12a多肽，或权利要求5至16中任一项所述的融合蛋白。18.权利要求17所述的多核苷酸，其中编码所述经修饰的LbCas12a多肽的所述多核苷酸或编码所述融合蛋白的所述多核苷酸与启动子可操作地关联，任选地，其中所述启动子是包含内含子的启动子区。19.权利要求17或权利要求18所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸经密码子优化以在生物体中表达。20.权利要求17至19中任一项所述的多核苷酸，其中所述生物体是动物、植物、真菌、古菌或细菌。21.一种复合物，其包含权利要求1至4中任一项所述的经修饰的LbCas12a多肽，或权利要求5至16中任一项所述的融合蛋白，以及引导核酸(例如，CRISPR RNA、CRISPR DNA、crRNA、crDNA)。22.一种编码权利要求21所述的复合物的核酸构建体。
23.一种组合物，其包含(a)权利要求1至4中任一项所述的经修饰的LbCas12a多肽，或权利要求5至16中任一项所述的融合蛋白，以及(b)引导核酸。24.一种表达盒或载体，其包含权利要求17至20中任一项所述的多核苷酸，或权利要求22所述的核酸构建体。25.一种V型簇状规律间隔性短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)(CRISPR
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Cas)系统，其包含：(a)融合蛋白，其包含(i)权利要求1至4中任一项所述的经修饰的LbCas12a多肽或编码权利要求1至4中任一项所述的经修饰的LbCas12a多肽的核酸，和(ii)感兴趣的多肽或编码所述感兴趣的多肽的核酸；以及(b)包含间隔子序列和重复序列的引导核酸(CRISPR RNA、CRISPR DNA、crRNA、crDNA)，其中所述引导核酸能够与所述经修饰的LbCas12a多肽或所述融合蛋白形成复合物，并且所述间隔子序列能够与靶核酸杂交，从而将所述经修饰的LbCas12a多肽和所述感兴趣的多肽引导至所述靶核酸，由此对所述靶核酸进行修饰(例如，切割或编辑)或调节(例如，调节转录)。26.权利要求25所述的系统，其中所述经修饰的LbCas12a多肽包含核酸酶活性位点(例如，RuvC结构域)中的突变(例如，失活Cas12a，dCas12a)。27.权利要求25或权利要求26所述的系统，其中所述感兴趣的多肽连接至所述经修饰的LbCas12a多肽的C
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末端和/或N
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末端。28.权利要求25至27中任一项所述的系统，其中所述感兴趣的多肽经由接头，任选地经由肽接头，连接至所述经修饰的LbCas12a多肽的C
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末端和/或N
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末端。29.权利要求25至28中任一项所述的系统，其中所述感兴趣的多肽包含至少一种具有下列活性的多肽或蛋白结构域：脱氨酶(脱氨基)活性、切口酶活性、重组酶活性、转座酶活性、甲基化酶活性、糖基化酶(DNA糖基化酶)活性、糖基化酶抑制剂活性(例如，尿嘧啶
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DNA糖基化酶抑制剂(UGI))、去甲基化酶活性、转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸酶活性、单链RNA切割活性、双链RNA切割活性、限制性内切核酸酶活性(例如，Fok1)、核酸结合活性、甲基转移酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性和/或光裂合酶活性。30.权利要求25至29中任一项所述的系统，其中所述感兴趣的多肽包含至少一种具有脱氨酶活性的多肽或蛋白结构域。31.权利要求30所述的系统，其中所述至少一种具有脱氨酶活性的多肽或蛋白结构域是胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域。32.权利要求31所述的系统，其中所述胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：成对植物服务股份有限公司，
类型：发明
国别省市：