【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于使用双独特双索引的高通量样品制备的方法和组合物
交叉引用
[0001]本申请要求2019年7月22日提交的美国临时申请号62/877,197和2019年9月18日提交的美国临时申请号62/901,958的权益，其各自通过引用以其全文并入本文。
技术介绍
[0002]二代测序仪现在能够生成每个流动池高达3000Gbp的短读段序列数据。为了利用这种规模的测序，可能需要在测序过程中多路复用样品。这可以通过向DNA文库添加分子条形码进行测序，并使用这些条形码对单个样品进行解复用以进行分析来实现。文库构建方法可以包括片段化、平端修复、A加尾和通用条形码衔接子的连接。可替代地，文库构建可以包括非片段化的制备方法(例如RipTide)和酶切法片段化方法(例如Nexterra)。
技术实现思路
[0003]在一方面，本文提供了从核酸样品制备测序文库的方法，其包括：(a)将包含第一条形码序列和第一随机序列的第一寡核苷酸退火至所述核酸样品。在一些情况下，该方法还包括(b)延伸所述第一寡核苷酸以获得第一延伸产物，所述第一延伸产物包含所述...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从核酸样品制备测序文库的方法，其包括：(a)将包含第一条形码序列和第一随机序列的第一寡核苷酸退火至所述核酸样品；(b)延伸所述第一寡核苷酸以获得第一延伸产物，所述第一延伸产物包含所述第一条形码序列、所述第一随机序列和第一样品序列；(c)将包含所述第一条形码序列和第二随机序列的第二寡核苷酸退火至所述第一延伸产物；(d)延伸所述第二寡核苷酸以获得第二延伸产物，从而获得包含所述第一延伸产物和所述第二延伸产物的第一双链延伸产物，所述第二延伸产物包含所述第一条形码序列、所述第二随机序列和所述第一样品序列的互补序列；和(e)将包含第二条形码的第三寡核苷酸附接至所述第一延伸产物，并且将包含所述第二条形码的第四寡核苷酸附接至所述第二延伸产物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一条形码对所述核酸样品具有特异性。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二条形码对一组核酸样品具有特异性。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸使用链置换聚合酶实现。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸使用逆转录酶实现。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一随机序列和所述第二随机序列包含适合所述核酸样品的GC含量。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一延伸产物和第二延伸产物包含约100至约200个碱基的长度。8.根据权利要求1所述的方法，其还包括纯化所述第一双链延伸产物。9.根据权利要求1所述的方法，其还包括对所述第一双链延伸产物进行末端修复反应。10.根据权利要求1所述的方法，其还包括对所述核酸样品进行磷酸化反应。11.根据权利要求9所述的方法，其还包括在(d)之后用λ核酸外切酶降解所述核酸样品。12.根据权利要求1所述的方法，其还包括对所述第一双链延伸产物进行磷酸化反应。13.根据权利要求1所述的方法，其还包括对所述第一双链延伸产物进行聚腺苷酸化反应。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三寡核苷酸还包含所述第二条形码的反向互补核酸序列，所述反向互补核酸序列形成发夹。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述附接包括连接。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述附接包括化学缀合。17.根据权利要求1所述的方法，其还包括对步骤(e)的产物进行PCR。18.根据权利要求1所述的方法，其还包括向所述双链延伸产物添加测序衔接子。19.根据权利要求1所述的方法，其还包括对所述双链延伸产物进行测序。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸样品包含未被片段化的基因组DNA。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸样品包含RNA。22.根据权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(a)中使包含所述第一条形码序列和第一引物序列的第五寡核苷酸退火，以及在步骤(c)中使包含所述第一条形码序列和第二引物序列的第六寡核苷酸退火，其中所述第一引物序列和所述第二引物序列被配置用于退
火至靶序列。23.一种从核酸样品制备测序文库的方法，其包括：(a)使包含第一条形码序列和第一引物序列的第一寡核苷酸退火至所述核酸样品；(b)延伸所述第一寡核苷酸以获得第一延伸产物，所述第一延伸产物包含所述第一条形码序列、所述第一引物序列和第一靶序列；(c)将包含所述第一条形码序列和第二引物序列的第二寡核苷酸退火至所述第一延伸产物；(d)延伸所述第二寡核苷酸以获得第二延伸产物，从而获得包含所述第一延伸产物和所述第二延伸产物的第一双链延伸产物，所述第二延伸产物包含所述第一条形码序列、所述第二引物序列和所述第一靶序列；和(e)将包含第二条形码的第三寡核苷酸附接至所述第一延伸产物和所述第二延伸产物。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一条形码对所述核酸样品具有特异性。25.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二条形码对一组核酸样品具有特异性。26.根据权利要求23所述的方法，其中所述延伸使用链置换聚合酶实现。27.根据权利要求23所述的方法，其中所述延伸使用逆转录酶实现。28.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一引物序列和所述第二引物序列包含适合所述核酸样品的GC含量。29.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一延伸产物和第二延伸产物包含约100至约200个碱基的长度。30.根据权利要求23所述的方法，其还包括纯化所述第一双链延伸产物。31.根据权利要求23所述的方法，其还包括对所述第一双链延伸产物进行末端修复反应。32.根据权利要求23所述的方法，其还包括对所述核酸样品进行磷酸化反应。33.根据权利要求32所述的方法，其还包括在(d)之后用λ核酸外切酶降解所述核酸样品。34.根据权利要求23所述的方法，其还包括对所述第一双链延伸产物进行磷酸化反应。35.根据权利要求23所述的方法，其还包括对所述第一双链延伸产物进行聚腺苷酸化反应。36.根据权利要求23所述的方法，其中所述第三寡核苷酸还包含所述第二条形码的反向互补核酸序列，所述反向互补核酸序列形成发夹。37.根据权利要求23所述的方法，其中所述附接包括连接。38.根据权利要求23所述的方法，其中所述附接包括化学缀合。39.根据权利要求23所述的方法，其还包括对步骤(e)的产物进行PCR。40.根据权利要求23所述的方法，其还包括向所述双链延伸产物添加测序衔接子。41.根据权利要求23所述的方法，其还包括对所述双链延伸产物进行测序。42.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸样品包含未被片段化的基因组DNA。43.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸样品包含RNA。44.根据权利要求23所述的方法，其还包括在步骤(a)中使包含所述第一条形码序列和
第一随机序列的第五寡核苷酸退火，以及在步骤(c)中使包含所述第一条形码序列和第二随机序列的第六寡核苷酸退火。45.一种从多个核酸样品多路复用测序文库的方法，其包括：(a)将第一多个寡核苷酸退火至所述多个核酸样品中的核酸样品，其中所述第一多个寡核苷酸中的每一个包含(i)对应于所述核酸样品的独特条形码序列和(ii)能够与所述核酸样品中的至少一个序列进行碱基配对的随机序列；(b)延伸所述第一多个寡核苷酸以获得第一多个延伸产物，其中所述第一多个延伸产物中的每一个包含(i)对应于所述核酸样品的所述独特条形码序列和(ii)样品序列；(c)将第二多个寡核苷酸退火至所述第一多个延伸产物，其中所述第二多个寡核苷酸中的每一个包含(i)对应于所述核酸样品的所述独特条形码和(ii)能够与所述第一多个延伸产物中的至少一个序列进行碱基配对的随机序列；(d)延伸所述第二多个寡核苷酸以获得第二多个延伸产物，其中所述第二多个延伸产物中的每一个包含(i)对应于所述核酸样品的所述独特条形码序列和(ii)所述样品序列，从而获得对应于所述核酸样品的多个双链延伸产物，所述多个双链延伸产物各自包含所述第一多个延伸产物的成员和所述第二多个延伸产物的成员；(e)合并对应于所述核酸样品中的每一个的所述多个双链延伸产物中的每一个以形成扩增核酸样品池；和(f)将对应于所述扩增核酸样品池的独特条形码序列与所述扩增核酸样品池的多个双链延伸产物中的每一个连接。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述延伸使用链置换聚合酶实现。47.根据权利要求45所述的方法，其中所述延伸使用逆转录酶实现。48.根据权利要求45所述的方法，其中所述随机序列包含适合所述核酸样品的GC含量。49.根据权利要求45所述的方法，其中所述多个延伸产物包含约100至约200个碱基的长度。50.根据权利要求45所述的方法，其还包括纯化所述多个双链延伸产物。51.根据权利要求45所述的方法，其还包括对所述多个双链延伸产物进行末端修复反应。52.根据权利要求45所述的方法，其还包括对所述核酸样品进行磷酸化反应...
【专利技术属性】
技术研发人员：基斯，
申请(专利权)人：艾格诺姆克斯国际基因组学公司，
类型：发明
国别省市：
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