人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂、试剂盒及定量方法技术

本发明专利技术提供一种人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，包括以下组分：第一试剂，包括缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂；第二试剂，包括连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体。本发明专利技术将缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂组合使用，再配合连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体实现对试样中人去唾液酸糖蛋白受体的快速检测，同时确保测定结果的精度。定结果的精度。定结果的精度。

Determination reagent, kit and quantitative method of human asialoglycoprotein receptor

【技术实现步骤摘要】
人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂、试剂盒及定量方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂、试剂盒及定量方法。

技术介绍

[0002]人去唾液酸糖蛋白受体(human asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是一种膜异源聚物，仅在肝细胞中表达。可溶性分泌形式sH2a不是通过在细胞表面脱落而产生的，而是通过其膜结合前体的细胞内切割而产生的，其由受体H2亚基的替代剪接形式编码。
[0003]ASGR2(asialoglycoprotein receptor 2)是异质低聚ASGPR的两个亚基之一，其在肝细胞上特异性表达。它也被称为H2，与另一个称为H1的亚基具有高同源性。ASGPR存在于肝细胞的质膜上，朝向正弦侧，并经历内吞循环。该受体是Ⅱ型膜蛋白，因此，ASGR2具有朝向细胞质的N端，一个跨膜区域，一个茎区和一个Ca
2+
依赖性CRD(碳水化合物识别结构域)。该亚基的分子量为～50kDa。
[0004]人去唾液酸糖蛋白受体H2亚基的H2a交替剪接变体与H2b变体的不同之处在于，膜跨旁边的外层域中存在额外的五肽EGHRG。当在细胞中没有H1亚基表达时，这种差异导致H2a在内质网中的保留和降解。相反，单表达的H2b的很大一部分被高尔基体处理并到达细胞表面。使用一种新的特异性抗H2a抗体，研究人员发现在HepG2细胞中，H2a被迅速切割成35
‑
kDa片段，该片段包含整个外层域,其中大部分分泌到培养基中。分泌片段的裂解位点位于膜跨的腔端。没有膜结合的H2a离开ER，表明五肽是ER保留和膜形式降解的信号，但不阻碍裂解的可溶性形式的分泌。H2a不像H2b那样与H1l形成膜受体复合物。因此，H2a不是受体的亚基，而是蛋白质分泌形式的前体；信号肽酶可能是导致可溶性片段裂解的原因。因此，近膜序列作为信号锚序列(H2b)或作为切割的信号序列，调节Ⅱ型膜蛋白的跨膜结构域的功能，其产生分泌产物(H2a)。
[0005]在健康个体的血清中发现了一种称为sH2a的ASGR2亚基的替代剪接形式。这种形式的血清水平在肝纤维化中发生变化，并定义肝细胞功能的状态。因此，它具有作为肝功能和纤维化的非侵入性标志物的潜力。
[0006]我国肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生率居于所有肿瘤发生率的第4位，目前肝癌诊断主要依靠影像学检查、血清标志物、穿刺活检等手段。其中血清标志物主要以公认并进入临床应用的甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体、异常凝血酶原等为代表，,随着蛋白质及分子生物学技术的发展，不断有新的标志物被发现并逐步应用于临床，如microRNA以及磷脂酰肌醇蛋白聚糖、N
‑
糖标志物等，但是仍远远不能满足临床对肝癌早期诊断及疾病分层管理的需求。
[0007]目前常见的sH2a检测方法仅见ELISA，对判断肝纤维化的发生、发展、恢复，以及相关癌症筛查和复发判断有很好的参考价值。但上述方法试剂盒均为采用单克隆抗体的固相法，并需标记检测抗体，生产制备繁琐，与且不适用高通量全自动生化分析仪应用。
[0008]由于sH2a蛋白结构简单，与H1和H2b同源型强、结构近似，不易获得适用于免疫比
浊类平台的有效抗体，故目前尚未发现应用于全自动生化分析仪的均相检测试剂盒。

技术实现思路

[0009]基于此，本专利技术的目的是提供一种人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂、试剂盒及定量方法，以至少解决上述相关技术中的不足。
[0010]本专利技术提出一种人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，包括以下组分：
[0011]第一试剂，包括缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂；
[0012]第二试剂，包括连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体。
[0013]本专利技术的有益效果在于：将缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂组合使用，再配合连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体实现对试样中人去唾液酸糖蛋白受体的快速检测，同时确保测定结果的精度。
[0014]另外，根据本专利技术提供的人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，还可以具有如下的技术特征：
[0015]所述缓冲液的浓度为10mmol/L～300mmol/L，且所述缓冲液为Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、双甘氨肽缓冲液中至少一种。
[0016]进一步的，所述抗干扰剂A包括表面活性剂、离液离子以及氨基酸；
[0017]其中，所述表面活性剂的浓度为0.01％～1.0％、且所述表面活性剂为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂中至少一种；
[0018]所述离液离子为溴化钠、硫氰酸钠、碘化钾中至少一种；
[0019]所述氨基酸为甘氨酸、双甘氨肽、天门冬氨酸钾、谷氨酸钠、谷氨酸中至少一种。
[0020]进一步的，所述分散剂为有机酸、糖类以及盐类中至少一种；
[0021]其中，所述有机酸的浓度为10mmol/L～200mmol/L，且所述有机酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸以及琥珀酸中至少一种；
[0022]所述糖类为蔗糖、山梨糖醇、甘露糖以及海藻糖中至少一种，所述蔗糖浓度为50g/L～300g/L，所述山梨糖醇的浓度为50mmol/L～300mmol/L，所述甘露糖的浓度为20mmol/L～150mmol/L，所述海藻糖的浓度为10mmol/L～100mmol/L；
[0023]所述盐类为氯化钠、硫酸钠、磷酸盐中至少一种，所述氯化钠的浓度为50mmol/L～500mmol/L，所述硫酸钠的浓度为10mmol/L～100mmol/L，所述磷酸盐的浓度为20mmol/L～200mmol/L。
[0024]进一步的，所述促凝剂的浓度为0.1％～6.0％、且所述促凝剂为聚乙二醇6000，聚乙二醇20000中至少一种。
[0025]进一步的，所述抗人去唾液酸糖蛋白受体抗体被固定在不溶性载体上，所述不溶性载体包括乳胶粒子、磁性粒子、二氧化硅粒子。
[0026]进一步的，所述第一试剂还包括防腐剂、螯合剂以及稳定剂。
[0027]本专利技术的另一个目的在于提出一种人去唾液酸糖蛋白受体的试剂盒，包括上述的测定试剂，所述试剂盒还包括含有已知浓度的sH2a浓度的标准试样。
[0028]进一步的，所述标准试样为含有缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖、甘露糖醇、吐温、EDTA、防腐剂的水和/或血清混合溶液。
[0029]本专利技术的另一个目的在于提出一种人去唾液酸糖蛋白受体的定量方法，用于非疾病的诊断和治疗目的，所述人去唾液酸糖蛋白受体的定量方法应用于上述的测定试剂，所述人去唾液酸糖蛋白受体的定量方法包括以下步骤：
[0030](1)将试样与所述第一试剂混合反应，得到第一反应液，所述第一试剂用于排除所述试样中高浓度乳糜和脂质的干扰，以及分散暴露所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，其特征在于，包括以下组分：第一试剂，包括缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂；第二试剂，包括连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，其特征在于，所述缓冲液的浓度为10mmol/L～300mmol/L，且所述缓冲液为Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、双甘氨肽缓冲液中至少一种。3.根据权利要求1所述的人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，其特征在于，所述抗干扰剂A包括表面活性剂、离液离子以及氨基酸；其中，所述表面活性剂的浓度为0.01％～1.0％、且所述表面活性剂为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂中至少一种；所述离液离子为溴化钠、硫氰酸钠、碘化钾中至少一种；所述氨基酸为甘氨酸、双甘氨肽、天门冬氨酸钾、谷氨酸钠、谷氨酸中至少一种。4.根据权利要求1所述的人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，其特征在于，所述分散剂为有机酸、糖类以及盐类中至少一种；其中，所述有机酸的浓度为10mmol/L～200mmol/L，且所述有机酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸以及琥珀酸中至少一种；所述糖类为蔗糖、山梨糖醇、甘露糖以及海藻糖中至少一种，所述蔗糖浓度为50g/L～300g/L，所述山梨糖醇的浓度为50mmol/L～300mmol/L，所述甘露糖的浓度为20mmol/L～150mmol/L，所述海藻糖的浓度为10mmol/L～100mmol/L；所述盐类为氯化钠、硫酸钠、磷酸盐中至少一种，所述氯化钠的浓度为50mmol/L～500mmol/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：万蒙，王学忠，
申请(专利权)人：江西乐成生物医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：