牛乳乳清主要过敏原α-乳白蛋白的IgE结合表位制造技术

本发明专利技术涉及乳清过敏原α

Main allergens of milk and whey \u03b1- IgE binding epitope of lactalbumin

【技术实现步骤摘要】
牛乳乳清主要过敏原
α
‑
乳白蛋白的IgE结合表位


[0001]本专利技术涉及分子生物学、免疫学、生物信息学领域，特别是涉及牛乳乳清主要过敏原α
‑
乳白蛋白的IgE结合表位。

技术介绍

[0002]牛乳及乳制品因含有较高的营养价值而备受广大消费者的青睐，但牛乳过敏引发的食品安全问题也被人们广泛关注。牛乳及牛乳制品是WHO/FAO认定的八大类主要过敏食物之一。牛奶蛋白过敏(cow
’
s milk allergy,CMA)是生命早期的一种常见疾病，患病率为2
–
7％，且呈现增加的趋势。据估计，欧洲国家2
–
3％的婴儿会出现牛乳过敏症状。在一项针对6768名中国婴儿的最新调查中，发现CMA患病率为2.69％。CMA分为免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介导、非lgE介导和混合(IgE与非IgE)介导。大约60％的CMA是IgE介导，即与体液免疫反应异常有关，尽管因研究人群和年龄的不同而略有差异。非IgE介导或两者混合介导的CMA相对少见。IgE介导的CMA发生机制是牛乳过敏原致敏机体免疫细胞并使之产生特异性IgE(specific IgE,slgE)，随后slgE与效应细胞结合使其处于致敏阶段；机体再次接触到同种过敏原会导致效应细胞脱颗粒和释放介质，如组胺等，最终导致皮肤系统、呼吸系统、胃肠道系统等出现临床症状，如湿疹、呼吸困难、腹痛、呕吐等，牛乳过敏严重时甚至会导致患者休克和死亡。
[0003]牛乳中含有30多种蛋白质，都具有潜在致敏性。目前认为酪蛋白、β
‑
乳球蛋白(β
‑
lactoglobulin,BLG)和α
‑
乳白蛋白(α
‑
lactalbumin,ALA)是主要过敏原。在20℃条件下调节脱脂乳pH至4.6，可得到两部分：其中凝固状态的酪蛋白占80％，溶液状态的乳清蛋白占20％。乳清蛋白中主要过敏原是β
‑
乳球蛋白和α
‑
乳白蛋白，分别占乳清蛋白组分的50％和25％。α
‑
乳白蛋白是一种属于溶菌酶家族的具有123个氨基酸残基的单体球状钙结合金属蛋白，分子量为14.4kDa，带有四个二硫键和一个钙的高亲和力结合位点。研究者在牛乳和人乳的乳白蛋白之间发现了明显的同源性，其中74％的残基相同，另外6％的残基显示出化学相似性。
[0004]表位是过敏反应的物质基础，可分为线性表位和构象性表位，前者由氨基酸残基线性排列组成，后者是氨基酸残基在空间相互靠近形成的能被免疫活性物质识别的特定三维结构。表位也可以按照表位的受体可分为T细胞表位与B细胞表位，B细胞表位指的是B细胞受体或B细胞分泌的特异性抗体识别的表位，如IgE表位和IgG表位。B细胞线性表位的长度通常有8
–
15个氨基酸。尽管有报道称线性表位可短至5个氨基酸，但能与IgE高活性结合的表位至少含有8个氨基酸。
[0005]近年来，肽阵列、噬菌体展示、X射线晶体学等技术都已经运用于食物过敏原表位的定位。噬菌体展示技术是一种基于噬菌体表面展示的目标多肽或蛋白进行筛选的体外选择系统，能实现抗体基因型和表现型的统一，由于其便捷、特异性强、操作方便等特点，被广泛用于表位定位。虽然对牛乳过敏蛋白，包括酪蛋白，β
‑
乳球蛋白，α
‑
乳白蛋白已进行了诸多的表位定位研究，但针对中国人群特异性的牛乳乳清过敏原的表位定位极少报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是获得了乳清过敏原α
‑
乳白蛋白的一个IgE结合线性表位，是牛乳过敏发生的物质基础，可用于研究牛乳过敏的机制和消减。
[0007]本专利技术的
技术实现思路
是：
[0008]一种牛乳乳清中主要过敏原α
‑
乳白蛋白的IgE结合表位，其氨基酸序列为：
11
Glu
‑
Leu
‑
Lys
‑
Asp
‑
Leu
‑
Lys
‑
Gly
‑
Tyr
‑
Gly
‑
Gly
‑
Val
‑
Ser
‑
Leu
‑
Pro
‑
Glu
‑
Trp
‑
Val
27
。
[0009]采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)筛选16个牛乳过敏儿童患者的血清。
[0010]以Hitrap Protein G HP亲和层析柱纯化的高纯度牛乳特异性抗体为靶分子，对噬菌体十二肽库进行亲和淘选。
[0011]利用生物信息学进行预测，最后获得α
‑
乳白蛋白的表位信息。
[0012]本专利技术的有益效果是：α
‑
乳白蛋白的IgE结合表位的专利技术，对牛乳过敏发生的分子机制，指导破坏表位的蛋白酶筛选，以及基于表位的低过敏性乳清蛋白制品的开发具有重大意义。
附图说明
[0013]图1是牛乳过敏患者特异性抗体水平；X轴：来自不同过敏患者的血清，左Y轴：ALA
‑
特异性IgE结合水平的OD值，右Y轴：ImmunoCAP测定的特异性IgE含量；
[0014]图2中A是Protein G亲和纯化电泳图；B是纯化抗体的ELISA结果；M为蛋白Marker，泳道1为牛乳过敏患者血清池蛋白，泳道2为非特异性洗脱峰收集蛋白；
[0015]图3是噬菌体克隆子的间接ELISA检测结果；
[0016]图4是α
‑
乳白蛋白的IgE线性表位；
[0017]图5是斑点印迹验证IgE线性表位；
[0018]具体实施方法
[0019]一、牛乳过敏患者血清池的构建
[0020]1、间接ELISA筛选牛乳过敏患者血清
[0021]过敏患者血清中针对牛乳蛋白的sIgE水平由ImmunoCAP检测，选择牛乳蛋白sIgE水平大于等于0.35kUA/L并且年龄在3
–
12岁的血清进行ELISA。利用间接ELISA法测定牛乳过敏患者血清中抗α
‑
乳白蛋白特异性免疫球蛋白E(α
‑
lactalbumin specific immunoglobulin E，ALA
‑
sIgE)(间接ELISA的方法参考李柳栩的论文，论文出处：李柳栩.基于ELISA方法的卵类黏蛋白IgE线性表位研究[D].天津医科大学,2020:11
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16.)。
[0022]包被液为pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，洗液、封阻液、血清、二抗等均使用0.01M的PBS缓冲液稀本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛乳乳清主要过敏原α
‑
乳白蛋白的IgE结合表位，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID No：1：
11
Glu
‑
Leu
‑
Lys
‑
Asp
‑
Leu
‑
Lys
‑
Gly
...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭宏凯，胡巍，熊子奕，胡永芯，邱毓，黎晶晶，李欣，陈红兵，武涌，孟轩夷，
申请(专利权)人：谭宏凯，
类型：发明
国别省市：