一种水曲柳U6基因启动子proFmU6.5及其克隆与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种水曲柳U6基因启动子proFmU6.5及其克隆与应用。本发明专利技术首次成功克隆了水曲柳RNA聚合酶Ⅲ型启动子——水曲柳内源U6基因启动子proFmU6.5，并成功构建了水曲柳U6基因启动子活性检测载体，通过瞬时转化水曲柳幼苗、GUS染色验证，证明该启动子具有高效转录活性，为水曲柳及近缘植物的转化研究提供了高效的启动子序列。了高效的启动子序列。了高效的启动子序列。

A U6 gene promoter profmu6.5 of Fraxinus mandshurica and its cloning and Application

【技术实现步骤摘要】
一种水曲柳U6基因启动子proFmU6.5及其克隆与应用


[0001]本专利技术属生物
，特别是植物转基因
，具体涉及一种水曲柳RNA聚合酶Ⅲ型启动子，更具体涉及一种水曲柳U6基因启动子proFmU6.5，并进一步公开其克隆方法和应用。

技术介绍

[0002]水曲柳是木犀科白蜡属落叶大乔木，被列为国家二级保护渐危种，木材总体强度高、抗震性好、木质优良，常用于建筑、家具等，具有重要的经济价值。自1983年首次获得烟草转基因植株后，木本植物的遗传转化也得到重视，遗传转化作为林木基因工程的一个重要组成部分，在木本植物抗病、抗虫、改良性状以及基因工程育种中发挥重要作用。在生命科学领域，突变体对于基因功能的研究具有至关重要的作用。然而，林木世代周期长、遗传杂合度高、基因组倍性复杂，传统的随机诱变方法往往需要构建大群体的突变体库，并进行大规模筛选才能获得目的基因功能丧失的突变体，这一过程需要大量的人力和物力。相比之下，基因组定点编辑技术具有巨大优势，能够直接在基因组特定位置引入突变。
[0003]CRISPR/Cas9系统是目前公认的最具有发展潜力的基因编辑技术，Cas9酶在sgRNA引导下定向切割目标位点，对目标基因进行精准编辑。相较于锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator
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like effector nucleases,TALENs)技术，CRISPR/Cas9系统设计流程简单、操作方便、基因编辑效率高，一经开发被迅速广泛应用于动物、植物、微生物的研究中。自2013年CRISPR/Cas9首次用于模式植物拟南芥和烟草以来，该基因编辑系统已运用于包括水稻(Nekrasov等，Nat Biotechnol,2013,31(8):691
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693.)、小麦(Wang等,Nature biotechnology,2014,32(9):947
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951.)、玉米(Zhen等,Journal of Genetics and Genomics,2014,41(2):63
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68.)、高粱(Jiang等,Nucleic acids research,2013,41(20):e188.)、二穗短柄草、番茄(Brooks等,Plant Physiology,2014,166(3):1292
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1297)等内的24个科45个属的植物(Shan等,Applications in plant sciences,2020,8(1):e11314.)，在提高作物产量、品质、抗性等方面具有良好的应用前景。CRISPR/Cas9系统的出现同样也为林木基因功能研究和遗传改良起到了很大的促进作用。但相较于草本植物和粮食作物，CRISPR/Cas9系统在木本植物的相关研究及应用较为滞后，多数仍处于基因编辑体系的建立阶段。柑橘属植物是最早尝试应用CRISPR/Cas9进行基因编辑的木本植物，此外该技术还成功应用于猕猴桃属、葡萄属、苹果属、石榴属、咖啡属、可可属、木薯属等。同时，其在杨树等经济木本植物中的成功应用展现了CRISPR/Cas9系统在调控植物逆境耐受性和缩短林木育种周期等方面的巨大潜力，实现了抗旱、抗病等林木的新品种培育，为林木基础研究和分子育种提供了新的途径，为精准改良植物性状和选育新品种提供了新的思路。
[0004]为提高CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率，人们不断对载体进行优化。决定靶点特异性的sgRNA是一段具有特定二级结构的小RNA，通常由U3/U6系列启动子驱动。U3/U6启动子是CRISPR/Cas9基因编辑系统的重要元件之一，其转录起始位点分别为A和G，且转录活性
较高。其中U3多用于单子叶植物，U6多用于双子叶植物。选择具有明确起始位点的U3或U6启动子，能够精确引导sgRNA的转录，从而减少无关DNA转录带来的脱靶效应。虽然U3/U6已在多个物种的基因编辑中成功运用，但同一启动子在同源关系较远的物种间并不一定适用，且同一物种基因中常存在多个U3或U6启动子，其活性及转录效率存在一定差异。因此克隆出更多目标植物的内源U3/U6启动子，有利于CRISPR/Cas9基因编辑系统的完善。凡惠金等人在毛竹中克隆出两个PeU3启动子并进行不同长度的截短，发现不同启动子及同一启动子不同截短长度时转录活性不同(凡惠金等,植物学报,2020,55(03):299
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307.)。浦艳等在番茄中验证启动子转录活性时发现克隆的U3启动子长度在250bp以内仍具有转录活性(蒲艳,华北农学报,2019(1):33
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39.)。基于构建CRISPR/Cas9基因编辑载体的需要，所用的U3/U6启动子在保证其具有较高转录活性的基础上，长度要求尽量短，以保证尽可能不含有酶切位点，已有研究表明，用于CRISPR/Cas9基因编辑技术的U6启动子通常只有200
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400bp长(Fauser等,The Plant Journal,2014,79(2):348
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359.)，甚至短于100bp(Vladimir等,Nature biotechnology,2013,31(8):691
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693.)。Long等利用棉花内源U6启动子将sgRNA的表达水平提高了6
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7倍，基因编辑效率也提高了4
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5倍(Longs等,Plant Methods.2018,14(1):80.)。刘春霞等人利用番茄U6启动子驱动sgRNA的表达，与拟南芥的U6启动子驱动的sgRNA相比较，番茄基因编辑效率从63％提高到73％(刘春霞等,分子植物育种,2020,18(20):6716
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6724.)。
[0005]成功建立应用于水曲柳的CRISPR/Cas9基因编辑体系将为水曲柳定向突变体库的获取提供高效可靠的技术支持，为深入研究水曲柳基因功能及其基因资源的开发利用提供宝贵的材料基础。然而，迄今为止，在水曲柳上对U6启动子仍然缺乏研究，缺少适用的、尽可能短且具有较高转录活性的内源U6启动子已成为水曲柳CRISPR/Cas9基因编辑系统构建的限制因子，也限制了CRISPR/Cas9系统在水曲柳遗传育种及种质创新等方面的应用。因此，优先克隆出具有高效转录活性的水曲柳内源FmU6启动子，对水曲柳CRISPR/Cas9载体构建、水曲柳功能基因研究及遗传育种具有重要的研究意义及应用价值。

技术实现思路

[0006]针对目前研究现状，本专利技术的目的是提供一种水曲柳U6基因启动子FmU6.5和该启动子的克隆方法及应用。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了一种水曲柳内源U6基因启动子proFmU6.5，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]优选地，所述水曲柳U6基因启动子proFmU6.5属于水曲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水曲柳U6基因启动子proFmU6.5，其特征在于，所述启动子proFmU6.5的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种基因启动子克隆方法，其特征在于，一种克隆权利要求1所述的水曲柳U6基因启动子proFmU6.5的方法，包括以下步骤：(1)以水曲柳DNA为模板，设计特异引物proFmU6.5
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F:AGACAGCAAAGCACCTTGAGAG，proFmU6.5
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R:TTATTGGTGGAACCCGCC(2)使用LA Taq酶在50μL体系中进行PCR扩增；(3)将扩增产物克隆到pCloneEZ
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TOPO载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取重组单克隆测序，获取长度为1863bp的水曲柳U6基因启动子proFmU6.5。3.根据权利要求2所述的克隆所述的水曲柳U6基因启动子proFm...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛颖，高尚珠，曾凡锁，陈晓慧，石宝英，王亮，于海洋，张艳明，颜嘉蔚，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：