斑马鱼排卵障碍模型的构建方法、检测方法及应用技术

本发明专利技术提供了斑马鱼排卵障碍模型的构建方法、检测方法及应用，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术提供了用于特异性敲除斑马鱼cyp21a2基因的sgRNA，通过CRISPR/Cas9技术构建并选育出cyp21a2基因缺失型斑马鱼，获得了斑马鱼排卵障碍模型。本发明专利技术所构建的斑马鱼排卵障碍模型同时具备高雄激素和高促黄体激素的内分泌特征，为深入解析内分泌激素调控排卵机制研究提供了良好的模型材料。供了良好的模型材料。供了良好的模型材料。

Construction method, detection method and application of zebrafish ovulation disorder model

【技术实现步骤摘要】
斑马鱼排卵障碍模型的构建方法、检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其是涉及斑马鱼排卵障碍模型的构建方法、检测方法及应用。

技术介绍

[0002]排卵障碍包括稀发排卵和无排卵，占不孕症患者病因的25％，其病因复杂，准确定位及评估排卵障碍发病机制是有效治疗的关键(闫阳等，2021)。内分泌失调是多种排卵障碍的主要表现，包括以高雄激素为特征的多囊卵巢综合征，和以高促黄体激素为特征的卵巢不敏感综合征(Ruan X等，2018；Manna PR等，2016和Zhang Y等，2018)。这些疾病的发病机制复杂，涉及途径繁多，因此，不孕模型的成功构建为明确该类疾病的致病原因、早期诊断和治疗奠定了基础。
[0003]cyp21a基因定位于人类6p21.3，有真基因和假基因两个基因组成。cyp21a基因为编码21羟化酶的功能基因，该酶催化17
‑
羟孕酮(17
‑
OHP)转化为11
‑
脱氧皮质醇，同时催化孕酮转化为11
‑
脱氧皮质酮，二者分别是皮质醇和醛固酮的前体。
[0004]21羟化酶活性降低致使皮质醇和醛固酮合成受损，最终导致高雄激素血症，临床上表现为女性男性化、不育等症状(例如先天性肾上腺皮质增生症，CAH)。目前，为了研究由cyp21a基因突变引起的CAH即先天性肾上腺皮质增生症21羟化酶缺乏型(21OHD)，人们构建了21OHD老鼠模型和利用TALEN法构建的cyp21a基因突变斑马鱼模型(TOSHIHIRO TAJIMA等，1999；M Perdomini等，2017和Helen Eachus等，2017)，而老鼠模型存在很难养活的问题，斑马鱼模型存在尚未出现排卵障碍性状的问题。因此，有必要继续研究和开发cyp21a基因突变相关的排卵障碍模型，为排卵障碍发病机制的研究提供基础。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种高LH和T激素内分泌特征的排卵障碍模型的构建方法、检测方法及应用。本专利技术提供了用于特异性敲除斑马鱼cyp21a2基因的sgRNA，通过CRISPR/Cas9技术构建并选育出cyp21a2基因缺失型斑马鱼，获得了斑马鱼排卵障碍模型。本专利技术所构建的斑马鱼排卵障碍模型同时具备高雄激素(T)和高促黄体激素素(LH)的内分泌特征，为深入解析内分泌激素调控排卵机制研究提供了良好的模型材料。
[0007]本专利技术提供的技术方案如下：
[0008]在一个方面，本专利技术提供了用于斑马鱼cyp21a2基因敲除的sgRNA，所述sgRNA的DNA序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
[0009]本专利技术中提供的sgRNA是基于CRISPR/Cas9技术，特异性敲除斑马鱼cyp21a2基因构建斑马鱼排卵障碍模型的sgRNA。
[0010]在另一个方面，本专利技术提供了一种CRISPR/Cas9组合物，所述组合物包含前述sgRNA或编码权利要求1前述sgRNA的DNA，以及Cas9蛋白。
[0011]在本专利技术中，本专利技术还涵盖包含前述的靶向斑马鱼cyp21a2基因的sgRNA或前述的CRISPR/Cas9组合物的试剂盒等相关检测产品。
[0012]在另一个方面，本专利技术提供了前述的sgRNA或前述的CRISPR/Cas9组合物在制备斑马鱼排卵障碍模型的应用；优选地，所述应用为在构建斑马鱼高雄激素和高促黄体激素不孕模型中的应用。
[0013]本专利技术利用设计的sgRNA与Cas9蛋白的组合物进行基因编辑，获得了敲除斑马鱼cyp21a2基因的斑马鱼突变体，即斑马鱼模型，该斑马鱼模型具有排卵障碍，特别是高雄激素和高促黄体激素型排卵障碍。
[0014]本专利技术还涵盖前述的sgRNA或前述的CRISPR/Cas9组合物在制备斑马鱼cyp21a2基因敲除的细胞系中的应用。
[0015]在另一个方面，本专利技术提供了一种cyp21a2基因功能缺失的斑马鱼突变体的制备方法，所述方法包括：
[0016](a)将前述的sgRNA和Cas9蛋白共同导入斑马鱼受精卵中；
[0017](b)培养获得稳定遗传的cyp21a2基因功能缺失的斑马鱼突变体。
[0018]在另一个方面，本专利技术提供了前述制备方法获得的斑马鱼基因突变体，该突变体斑马鱼cyp21a2基因第二外显子上46bp片段被敲除，被敲除的序列如SEQ ID No.5所示：CATTCACTCTATAAGCTCTTCTTCAGTACCGTTTCTCCAACTATTT。
[0019]在另一个方面，本专利技术提供了一种斑马鱼排卵障碍模型的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0020](A)设计并合成用于靶向斑马鱼cyp21a2基因第二外显子的sgRNA；所述sgRNA的DNA序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
[0021](B)将有活性的sgRNA(步骤(A)中得到的)和Cas9蛋白的组合物经显微注射入斑马鱼受精卵中；
[0022](C)培育显微注射后的受精卵，获得F0代斑马鱼，将阳性斑马鱼与野生型杂交，得到F1代杂合子，自交，得到F2代纯合突变体，即得斑马鱼排卵障碍模型。
[0023]在一个实施方案中，所述方法还包括将得到的F2代纯合突变体培养至成鱼，选出雌鱼，检测激素水平，获得斑马鱼高雄激素和高促黄体激素不孕模型。
[0024]在一个实施方案中，所述sgRNA和Cas9蛋白的组合物中，sgRNA的终浓度为80
‑
150ng/μL；Cas9蛋白终浓度为200
‑
300ng/μL；优选地，每个受精卵注射所述组合物的体积为0.8
‑
1.2nL。
[0025]在一个具体的实施方案中，sgRNA的终浓度为80
‑
150ng/μL；Cas9蛋白终浓度为200
‑
300ng/μL；注射量为1nL。
[0026]在一个实施方案中，在斑马鱼胚胎1
‑
2细胞期进行显微注射。
[0027]具体地，本专利技术的构建方法包括：
[0028]1)、靶向cyp21a2基因的sgRNA和检测引物的筛选：sgRNA序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，检测引物序列如SEQNO.3至SEQNO.4所示；
[0029]2)、将sgRNA和Cas9蛋白混合物注射到斑马鱼受精卵中；
[0030]3)、F0代突变斑马鱼筛选：筛选出敲出有效的胚胎，培养至成鱼，获得F0代突变斑马鱼；
[0031]4)、获得可遗传的斑马鱼突变体F1代：将F0代突变斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，筛选得到可遗传的斑马鱼突变体的F1代。
[0032]5)、获得斑马鱼F2代纯合突变体：将F1代突变斑马鱼自交得到F2代，筛选得到斑马鱼F2代纯合突变体。
[0033]6)、获得斑马鱼高雄本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于斑马鱼cyp21a2基因敲除的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的DNA序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。2.一种CRISPR/Cas9组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的sgRNA或编码权利要求1所述sgRNA的DNA，以及Cas9蛋白。3.权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的CRISPR/Cas9组合物在制备斑马鱼排卵障碍模型的应用；优选地，所述应用为在构建斑马鱼高雄激素和高促黄体激素不孕模型中的应用。4.一种cyp21a2基因功能缺失的斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：(a)将权利要求1所述的sgRNA和Cas9蛋白共同导入斑马鱼受精卵中；(b)培养获得稳定遗传的cyp21a2基因功能缺失的斑马鱼突变体。5.根据权利要求4所述的制备方法获得的斑马鱼基因突变体，其特征在于，斑马鱼cyp21a2基因第二外显子上46bp片段被敲除，被敲除的序列如SEQ ID No.5所示。6.一种斑马鱼排卵障碍模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(A)设计并合成用于靶向斑马鱼cyp21a2基因第二外显子的sgRNA；所述sgRNA的DNA序列为SEQ ID No.1和SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓彦，侯吉伦，王桂兴，韩甜，刘玉峰，何忠伟，王玉芬，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院北戴河中心实验站，
类型：发明
国别省市：