基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：1)样品前处理：取样品，加入内标工作液，混匀；加入乙腈与乙醇的混合溶液，涡旋震荡；加入正己烷，震荡，离心；取最上层有机层，用于氮气吹干，用含有抗坏血酸的甲醇复溶，混匀，作为待测样品；2)采用液相色谱串联质谱法对待测样品进行分析，检测样品中维生素K1的浓度。本发明专利技术提供的方法能够利用ESI源与液相色谱结合，在不需要进行衍生化处理的前提下实现VK1的高精度检测，且与使用APCI源的结果相比较，本发明专利技术的测试结果在灵敏度和精密度上均有显著提升；本发明专利技术的方法还具有操作简便，通用性高等特点，具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。

Detection of vitamin K1 by liquid chromatography tandem mass spectrometry based on electrospray spray ionization source

【技术实现步骤摘要】
基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法


[0001]本专利技术涉及分析检测
，特别涉及一种基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法。

技术介绍

[0002]维生素K1(Phylloquinone，VK1)，即2
‑
甲基
‑3‑
叶绿基
‑
1,4
‑
萘醌，简称叶绿醌，VK1是一种脂溶性维生素，为黄色至橙黄色的透明黏稠液体，广泛存在于绿色植物中，作为肝脏凝血酶原形成的必需物质，VK1可以调节和控制凝血因子
Ⅶ
、
Ⅸ
、
Ⅹ
的合成，可用于治疗出血。此外，VK1还与临床多种疾病相关，如出血性疾病、骨代谢、心血管疾病、糖尿病、关节炎、结石等。准确检测血清中VK1的含量对预防VK1缺乏症具有重要指导意义。
[0003]随着对VK1研究的深入，国内外研究者开发了一系列VK1检测方法，方法集中在高效液相色谱法(HPLC)、化学发光法、高效液相色谱串联质谱法(HPLC
‑
MS/MS)等，其中HPLC
‑
MS/MS法以其灵敏度高、选择性强、抗干扰能力强等优点，越来越多的在临床检测行业获得应用。VK1由于疏水性太强，且分子上缺乏电离位点，在电喷雾电离源(ESI源)下VK1的响应很小，同时血清中的VK1含量太低，导致ESI源不能满足VK1检测灵敏度的要求；为解决这个问题，研究者们只能采用大气压化学电离源(APCI源)进行VK1的检测，APCI适合于分析非极性化合物，现有技术中，为检测血清中的VK1，研究者们只有在APCI源甚至中高端型号质谱仪的APCI源下，或将VK1进行衍生化处理，VK1的检测灵敏度才能得到保证。如现有技术CN113933410A报道了一种同时检测VK1、MK4和MK7的方法，方法采用液液萃取法进行样品前处理，样品进行萃取、氮气吹干再复溶之后，使用APCI源进行检测；现有技术CN112903855A报道了一种高效液相色谱
‑
串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法，方法里首先对血清样品进行蛋白沉淀，然后使用正己烷进行液液萃取，离心移取上清液进行氮吹，再加入PTAD衍生试剂，50℃恒温震荡孵育30min，衍生化之后再加入乙醇震荡，然后氮气吹干，复溶之后进行目标物检测；该方案需要将VK1进行衍生化处理，其带来的缺陷为：样品处理过程繁琐复杂，效率低下，样品检测重现性差。现有技术CN113552229A公开了一种血清中维生素K1的高效液相色谱串联质谱检测方法，方法采用乙醇溶液进行蛋白沉淀，随后使用正己烷溶液进行液液萃取，仪器检测时使用了Sciex公司中高端型号的API 5500仪器测试样品，实验中使用的离子源同样为APCI源。
[0004]在实际工作中，通常是采用APCI源进行实验，对仪器维护的要求比较高，若想获得良好的峰型及高精密度数据，需要每天进行离子源的清洗维护，否则会出现峰形会变差、精密度下降等现象，而ESI源则没有这些特殊要求，ESI源作为液质联用中用途最广的离子源，可以检测弱极性至强极性的化合物，对非极性的物质检测响应偏低，导致ESI源对于VK1这类分子具有疏水性且缺乏电离位点的化合物进行检测存在技术障碍，很难使用ESI源进行这类化合物的分析。另一个问题在于VK1在血清中的浓度低至0.1ng/mL或甚至更低，为了检测到血清中的VK1，科研工作者们普遍采用APCI源进行VK1的分析，而实验室其他项目则基本用ESI源进行测试，这种方式势必造成工作的不便利，需要频繁的更换离子源，而经常性
拆卸离子源还会造成离子源卡子的损坏。因此需要提供一种可带来操作简便、结果稳定、重复性好的方法检测血清中的VK1。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
[0007]1)样品前处理：
[0008]1‑
1)取样品，加入内标工作液，混匀；
[0009]1‑
2)加入乙腈与乙醇的混合溶液，涡旋震荡；
[0010]1‑
3)加入正己烷，震荡，离心；
[0011]1‑
4)取最上层有机层，用于氮气吹干，用含有抗坏血酸的甲醇复溶，混匀，作为待测样品；
[0012]2)采用液相色谱串联质谱法对待测样品进行分析，检测样品中维生素K1的浓度；其中，质谱检测采用电喷雾电离源。
[0013]优选的是，所述步骤1)具体包括：
[0014]1‑
1)取100
‑
400μL样品，加入5
‑
20uL VK1
‑
d7内标工作液，混匀；
[0015]1‑
2)加入100
‑
400μL乙腈与乙醇的混合溶液，1000
‑
5000转/min下涡旋震荡60
‑
240S；
[0016]1‑
3)加入300
‑
1200μL正己烷，1000
‑
5000转/min下震荡60
‑
240S，于4℃下7000
‑
28000转/min离心2
‑
10min；
[0017]1‑
4)取最上层有机层250
‑
1000μL，用于氮气吹干，用50
‑
200μL含有抗坏血酸的甲醇复溶，1000
‑
5000转/min下混匀60
‑
240S，作为待测样品。
[0018]优选的是，所述步骤1
‑
2)中，乙腈与乙醇的混合溶液中，乙腈与乙醇体积比为1:1。
[0019]优选的是，所述步骤1
‑
4)中，甲醇中含有10μg/mL的抗坏血酸。
[0020]优选的是，所述步骤1)具体包括：
[0021]1‑
1)取200μL样品，加入10uL VK1
‑
d7内标工作液，混匀；
[0022]1‑
2)加入200μL乙腈与乙醇的体积比为1:1的混合溶液，2500转/min下涡旋震荡120S；
[0023]1‑
3)加入600μL正己烷，2500转/min下震荡120S，于4℃下14000转/min离心5min；
[0024]1‑
4)取最上层有机层500μL，用于氮气吹干，用100μL含有10μg/mL抗坏血酸的甲醇复溶，2500转/min下混匀120S，作为待测样品。
[0025]优选的是，所述步骤2)中，液相色谱检测中的流动相为：A相为含10mM氟化铵的水溶液，B相为含10mM氟化铵的甲醇溶液。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)样品前处理：1
‑
1)取样品，加入内标工作液，混匀；1
‑
2)加入乙腈与乙醇的混合溶液，涡旋震荡；1
‑
3)加入正己烷，震荡，离心；1
‑
4)取最上层有机层，用于氮气吹干，用含有抗坏血酸的甲醇复溶，混匀，作为待测样品；2)采用液相色谱串联质谱法对待测样品进行分析，检测样品中维生素K1的浓度；其中，质谱检测采用电喷雾电离源。2.根据权利要求1所述的基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：1
‑
1)取100
‑
400μL样品，加入5
‑
20uL VK1
‑
d7内标工作液，混匀；1
‑
2)加入100
‑
400μL乙腈与乙醇的混合溶液，1000
‑
5000转/min下涡旋震荡60
‑
240S；1
‑
3)加入300
‑
1200μL正己烷，1000
‑
5000转/min下震荡60
‑
240S，于4℃下7000
‑
28000转/min离心2
‑
10min；1
‑
4)取最上层有机层250
‑
1000μL，用于氮气吹干，用50
‑
200μL含有抗坏血酸的甲醇复溶，1000
‑
5000转/min下混匀60
‑
240S，作为待测样品。3.根据权利要求2所述的基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤1
‑
2)中，乙腈与乙醇的混合溶液中，乙腈与乙醇体积比为1:1。4.根据权利要求3所述的基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤1
‑
4)中，甲醇中含有10μg/mL的抗坏血酸。5.根据权利要求4所述的基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃素姿，周玉松，李艳杰，李艳，胡玮，程文播，
申请(专利权)人：天津国科医工科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：