一种具有抑制结肠癌细胞增殖活性的黑菊芋多酚的制备方法技术

一种具有抑制结肠癌细胞增殖活性的黑菊芋多酚的制备方法，属于食品功能性成分制备领域。所述方法为：以蒸馏水和乙醇为溶剂分两步提取并制备游离酚冻干粉。称取游离酚滤渣冻干粉，氢氧化钠水解，浓盐酸调节pH，乙酸乙酯震荡浸提，静置萃取，保留上清，重复3次，旋蒸除去乙酸乙酯，用料液比1：4～6量的去离子水溶解，制备黑菊芋结合酚冻干粉。游离酚或结合酚冻干粉用去离子水配制成1.5～2.5mg/mL的溶液；称取30g大孔树脂，湿法装柱，平衡后加入游离酚或结合酚溶液至饱和，乙醇洗脱，收集洗脱液，旋蒸后冻干即可。纯化后，游离酚的含量由1.48％～2.47％提高至46.36％～52.85％，结合酚的含量由1.23％～1.67％提高至45.23％～51.36％，极大地提高了黑菊芋多酚的纯度。大地提高了黑菊芋多酚的纯度。大地提高了黑菊芋多酚的纯度。

A preparation method of black Jerusalem artichoke polyphenols with inhibitory activity on colon cancer cell proliferation

【技术实现步骤摘要】
一种具有抑制结肠癌细胞增殖活性的黑菊芋多酚的制备方法


[0001]本专利技术属于食品功能性成分制备领域，具体涉及一种具有抑制结肠癌细胞增殖活性的黑菊芋多酚的制备方法。

技术介绍

[0002]结肠直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，每年全世界诊断出新病例超过100万，因结肠直肠癌死亡的人数近70万。结肠直肠癌已成为继肺癌、肝癌和胃癌之后的第四大致命癌症。
[0003]菊芋(Helianthus tuberosus)，又称洋姜、鬼子姜，属菊科向日葵属多年生草本植物，原产于北美温带地区，现今在我国西北地区广泛种植。菊芋的块茎和茎叶可作为中药材基源，其味甘、微苦、性凉，具有清热凉血和消肿的作用，茎叶10～15g煎汤内服或块茎1个生嚼服主治热病，肠热出血，跌打损伤和骨折肿痛。根茎捣烂外敷治无名肿毒和腮腺炎。
[0004]现代研究表明，菊芋富含菊糖和多酚等成分，具有双向调控血糖，降低胆固醇，促进机体矿物质吸收，调节免疫，调节肠道菌群，缓解便秘，对抗肥胖等生理功能。
[0005]黑菊芋是以菊芋为原料采用变温熟成工艺加工而成的新型食品，菊芋经加工成黑菊芋后，成分发生了较大的变化，果聚糖降解为单糖、二糖和低聚果糖，增加了类黑精成分，多酚含量也有显著提高，是鲜菊芋中的近5倍。多酚按照其与糖类、蛋白质等物质的结合程度分为游离型和结合型两类。游离多酚指能够用提取剂(如水、甲醇、乙醇、丙酮等)提取出来的多酚，主要包括一些游离型的酚酸、黄酮类、芪类、木脂素等；结合多酚存在于提取完游离多酚后的残渣中，这些多酚主要通过醚键、酯键等共价键与细胞壁组分如纤维素、半纤维素、木质素、果胶以及结构蛋白结合。结合酚主要包括原花青素、缩合单宁以及结合型的酚酸和黄酮类等，在人体内不能被胃和小肠消化吸收，但可经肠道微生物菌群发酵后发挥更强的生物活性。植物多酚最主要的生理活性是抗氧化作用，同时由于其多样的结构也使其具有多种生物活性，如预防老年痴呆、抗炎、抑菌、抗肿瘤、调节肠道菌群及心血管疾病等功效，植物多酚应用非常广泛，在药品及保健品等领域都有应用。
[0006]研究表明，5.0和10.0g/kg bw黑菊芋水提液可以有效促进便秘小鼠肠道蠕动，调节肠道菌群，代谢产生乙酸、丙酸和正丁酸，从而起到缓解便秘的功能。目前对于黑菊芋功能性揭示的研究主要以水提液或醇提液作为目标物，而溶液的成分较为复杂，包括糖类(葡萄糖、果糖、蔗糖、低聚果糖和果聚糖等)、多酚类和类黑精等多种成分，难以确定是哪种成分在起作用，因此有必要对水提物或者醇提物进行一定程度的纯化，富集有效成分，进行离体试验，明确活性成分，并揭示其作用机制，发现具有药用功效的先导型化合物，为佐证黑菊芋的保健功能和研究新型药物奠定理论基础。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是为了解决目前黑菊芋功能性溶液成分复杂，不利于分析其具体成分的作用的问题，提供一种具有抑制结肠癌细胞增殖活性的黑菊芋多酚的制备方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0009]一种具有抑制结肠癌细胞增殖活性的黑菊芋多酚的制备方法，所述方法具体为：
[0010]步骤一：将黑菊芋切成1.2～1.8cm厚的薄片，加入蒸馏水，胶体磨匀浆，超声提取，60目尼龙滤网过滤；重复3次，合并滤液，6000r/min离心10min，取上清液冻干，得粗多糖和粗多酚混合物冻干粉；按照料液比1g：4～6mL的比例加水复溶，再加入无水乙醇至其在溶液中终浓度为80％～85％，沉淀24～48h，虹吸取上清液，获得水提游离酚(此时多糖大多都在沉淀中)；滤渣加入15倍体积的70％乙醇，超声提取，离心取上清，滤渣重复提取3次，合并滤液；旋转蒸发除去乙醇，与水提游离酚合并，冻干得粗游离酚，滤渣冻干，用于结合酚的提取；
[0011]步骤二：称取步骤一得到的滤渣冻干粉，加入氢氧化钠溶液充分混匀，在50℃水浴中振荡水解40～50min，加入浓盐酸调节pH为2～3，然后用乙酸乙酯震荡浸提，静置萃取，保留上清液，重复3次，旋转蒸发除去乙酸乙酯，用料液比1：4～6量的去离子水溶解，冻干，得结合酚粗提粉；
[0012]步骤三：取适量步骤一得到的粗游离酚或步骤二得到的结合酚粗提粉，用去离子水配制成1.5～2.5mg/mL的溶液；称取30gNKAⅡ型大孔树脂，湿法装柱，平衡后加入黑菊芋游离酚或结合酚溶液至饱和，然后以80％乙醇作为解吸液进行洗脱，收集乙醇解吸溶液，旋转蒸发除去乙醇，余下溶液冻干，得黑菊芋游离酚或者结合酚纯化冻干粉，检测其多酚含量为45.23％～52.85％。
[0013]进一步地，步骤一中，黑菊芋薄片与蒸馏水的体积比为1：4～6。
[0014]进一步地，步骤一中，所述两次超声提取的条件分别为80℃超声提取20min，55℃超声提取20min。
[0015]进一步地，步骤一中，所述旋转蒸发的温度为45～50℃，转速为60～90r/min。
[0016]进一步地，步骤二中，所述滤渣冻干粉与氢氧化钠溶液的混合料液比为1g：13～15mL，所述氢氧化钠溶液的浓度为3.5～4.0mol/L。
[0017]进一步地，步骤二中，所述乙酸乙酯震荡浸提的温度为20～25℃，时间为10～15min。
[0018]进一步地，步骤三中，所述大孔树脂柱的柱直径为1.6cm，高度45cm。
[0019]进一步地，步骤三中，上样液和解吸液的体积分别为12.0～13.0BV(BV代表一个柱体积)和10.0BV。
[0020]进一步地，步骤三中，上样液和解吸液的流速均为1.0mL/min。
[0021]本专利技术相对于现有技术的有益效果为：黑菊芋中含量最多的是糖类物质，以水为溶剂提取多糖后所得残渣中富含多酚。残渣中的多酚包括游离酚和结合酚，已有黑菊芋游离酚和结合酚的制备工艺较为粗糙，所得多酚有效成分含量较低，本专利技术采用大孔树脂富集的方式对黑菊芋游离多酚和结合态多酚进行纯化，并制备成冻干粉。纯化后，游离酚的含量由1.48％～2.47％提高至46.36％～52.85％；结合酚的含量由1.23％～1.67％提高至45.23％～51.36％，极大地提高了黑菊芋多酚的纯度。离体试验表明，60.00μg/mL的黑菊芋游离酚可抑制结肠癌细胞SW480的增殖活性，48h细胞增殖抑制率为70.28％；62.50μg/mL的黑菊芋结合态多酚可抑制结肠癌细胞SW480的增殖活性，48h细胞增殖抑制率为70.42％。采用超高效液相质谱联用技术鉴定，游离酚成分中包括阿魏酸、原儿茶醛、绿原酸、1，3
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O
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二
咖啡酰奎宁酸和根皮苷酚，其组成比例为71.53：18.76：6.93：2.03：0.74；结合酚成分中包括水杨酸、香草醛、阿魏酸、奎宁酸、香草酸、乙基香兰素和没食子酸乙酯，其组成比例为81.92：53.08：9.92：7.67：6.00：2.50：1.00。以原儿茶醛、绿原酸和水杨酸分别进行离体试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有抑制结肠癌细胞增殖活性的黑菊芋多酚的制备方法，其特征在于：所述方法具体为：步骤一：将黑菊芋切成1.2～1.8cm厚的薄片，加入蒸馏水，胶体磨匀浆，超声提取，60目尼龙滤网过滤；重复3次，合并滤液，6000r/min离心10min，取上清液冻干，得粗多糖和粗多酚混合物冻干粉；按照料液比1g：4～6mL的比例加水复溶，再加入无水乙醇至其在溶液中终浓度为80％～85％，沉淀24～48h，虹吸取上清液，获得水提游离酚；滤渣加入15倍体积的70％乙醇，超声提取，离心取上清，滤渣重复提取3次，合并滤液；旋转蒸发除去乙醇，与水提游离酚合并，冻干得粗游离酚，滤渣冻干，用于结合酚的提取；步骤二：称取步骤一得到的滤渣冻干粉，加入氢氧化钠溶液充分混匀，在50℃水浴中振荡水解40～50min，加入浓盐酸调节pH为2～3，然后用乙酸乙酯震荡浸提，静置萃取，保留上清液，重复3次，旋转蒸发除去乙酸乙酯，用料液比1：4～6量的去离子水溶解，冻干，得结合酚粗提粉；步骤三：取适量步骤一得到的游离酚或步骤二得到的结合酚粗提粉，用去离子水配制成1.5～2.5mg/mL的溶液；称取30g大孔树脂，湿法装柱，平衡后加入黑菊芋游离酚或结合酚溶液至饱和，然后以80％乙醇作为解吸液进行洗脱，收集乙醇解吸溶液，旋转蒸发除去乙醇，余下溶液冻干，得黑菊芋游离酚或结合酚纯化冻干粉。2.根据权利要求1所述的一种具有抑制结肠癌细胞增殖活性的黑菊芋多酚的制备方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬妍茹，张正海，杨庆丽，董艳，李国巍，石杰，魏连会，
申请(专利权)人：黑龙江省科学院大庆分院，
类型：发明
国别省市：