向日葵的胚挽救和体外除草剂选择方法技术

向日葵是重要的油料作物。一般来说，具有改良的农艺性状的新培育品种通过常规育种程序开发。在本文中，我们描述了一种向日葵胚挽救以加速将性状引入至植物中的方法。此外，杂草是向日葵作物的显著问题。然而，没有许多用于向日葵的选择性除草剂。在本文中，使用胚挽救方法，我们进一步描述了体外除草剂选择方法。法。法。

【技术实现步骤摘要】
向日葵的胚挽救和体外除草剂选择方法


[0001]本专利技术涉及向日葵的胚挽救和体外除草剂选择方法的领域。

技术介绍

[0002]向日葵(Helianthus annuus)是世界上最重要的油料作物之一。常规育种产生了具有改良的农艺性状的培育品种。具有有价值的农艺性状表现的现代商业培育品种一般是雄性和雌性近交系的杂交品种。
[0003]常规向日葵育种程序涉及几个育种周期。可以利用胚挽救(embryo rescue，ER)技术通过生命周期缩短(LCS)而加速将性状引入到商业近交系中。以前发表的报道将ER技术主要用在与外来向日葵物种(其是许多农艺上有用的向日葵性状的来源)的远缘杂交的情形中。培养基组分，包括基础培养基、蔗糖浓度、维生素和植物生长调节剂(激素)是不同物种中ER实验方案的开发中的主要因素(Lulsdorf等人，2013)。
[0004]向日葵的一个问题是杂草以及来自杂草的竞争可以导致产量大量减少。来自杂草的竞争可以减少向日葵所接收的水分、营养素、光和/或空间的量。据报道因杂草导致的向日葵产量下降高达70％。例如，列当属植物(broomrape，Orobanche)是寄生于向日葵的专性寄生物。列当属植物以植物的根和芽为食，产生大量的种子。考虑到对寄生物的遗传抗性不完全，除草剂是针对列当属植物的重要防治成分。除草剂的组合作为杂草防治的优选方法，结合缺少可用的向日葵选择性除草剂，使得具有除草剂抗性的向日葵性状的开发至关重要(Sala等人，2012)。

技术实现思路

[0005]设计并实施了开发稳健的向日葵ER方法学的实验，目的是将我们的商业向日葵性状基因导入(Trait Introgression,TI)过程中胚至胚的生命周期缩短到小于或等于(≤)85天。应用此技术使得我们能够每年进行4代而非3代，使得能够更快地将性状改良的向日葵杂交品种投放到市场。另外，我们已经建立了体外除草剂选择实验方案作为ER过程的一部分，通过减小转变为除草剂耐受性状的近交系的群体大小而提高了我们的TI过程的效率。
[0006]在本文中提出了如下的方法和组合物：1)收获向日葵未成熟胚的方法，使得能够通过胚挽救(ER)有效地生成幼苗；2)用于体外ER的稳健的且不依赖基因型的方法；3)稳健的体外除草剂选择方法；以及4)通过所述的方法生成的植物。
附图说明
[0007]图1示出了来自授粉后14天头状花序的外圈2至内圈8的未成熟种子。
[0008]图2示出了分离后放置在培养基上的未成熟胚。
[0009]图3示出了健康ER幼苗的实例，从根颈至子叶的苗高大于等于(≥)1.5cm。
[0010]图4示出了健康ER植株的实例，所述植株具有2
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4条带有侧根的根和真叶。
具体实施方式
[0011]定义
[0012]如本文所用，“AIR”是指Ahasl1基因中导致对乙酰乳酸合酶(AHAS)抑制性除草剂耐受的突变。另外“AIR”还指提供对所述除草剂的抗性的性状。
[0013]如本文所用，“健康的ER幼苗生长”是指这样的幼苗：苗高(子叶和根颈区之间)≥1.5cm且≥85％的幼苗具有健康根。
[0014]如本文所用，“健康根”是指具有2
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4条主根以及侧根的植株。
[0015]如本文所用，“基因型”是指细胞或生物体的遗传组成。个体的“一组遗传标志物的基因型”包括存在于该个体中的一个或多个遗传标志物基因座的特异性等位基因。如本领域中所知，基因型可以与单个基因座或多个基因座相关，无论所述多个基因座相关或不相关和/或相连或不相连。在一些实施方案中，个体的基因型与一个或多个相关的基因相关，因为这些基因中的一个或多个参与目的表型的表达(例如，如本文所定义的数量性状)。因此，在一些实施方案中，基因型包括存在于个体内的在数量性状的一个或多个基因座处的一个或多个等位基因的总和。
[0016]如本文所用，“所需的性状、等位基因或基因型”是指经培育的向日葵物种所需的野生向日葵物种中的目的特征。此类“性状、等位基因或基因型”可以包括对带来列当属植物的生物体或病害的抗性。备选地，此类性状、等位基因或基因型可以包括改良的产量、蛋白质含量、含油量和组成、抗旱性和花期。
[0017]如本文所用，“基因导入”是指将来自一种植物的基因组(例如来自野生向日葵植物)的性状、等位基因或基因型引入至缺少此类性状、等位基因或基因型的另一植物(例如经培育的向日葵)的基因组中。
[0018]如本文所用，如本领域所公知的，“染色体”是指细胞核中的自我复制的遗传结构，其含有细胞DNA并携带基因的线性阵列。
[0019]如本文所用，“自交”或“自花授粉”是指通过自体受精或自花授粉产生种子，即，花粉和胚珠来自同一植株。
[0020]如本文所用，“F2”是指子二代。
[0021]如本文所用，“双子叶物种”是指作为双子叶植物类群的一部分的植物物种，因为所述植物的种子具有两个胚叶(子叶)。
[0022]如本文所用，“植物”是指处于发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。
[0023]如本文所用，术语“植物部分”是指并且表示植物的一部分，包括单个细胞和细胞组织(诸如在植物中完整的植物细胞)、细胞团和组织培养物，可以由这些再生植物。植物部分的实例包括，但不限于，来自花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、苗和种子的单个细胞和组织；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、苗、接穗、砧木、种子、原生质体、愈伤组织，等等。
[0024]如本文所用，术语“子代”是指特定杂交的后代。一般来说，子代来自两个个体的交配，尽管一些物种(特别是一些植物和雌雄同体动物)可以自交(即，同一植株充当雄性和雌性配子两者的供体)。后代可以是例如，F1、F2或任何后续的代。
[0025]如本文所用，“除草剂”是指对不期望的植物(例如，杂草)有毒并且用来防治所述不期望的植物(例如，杂草)的物质或化合物。除草剂可以是选择性的(对物种特异)或非选
择性的(广谱的)。
[0026]如本文所用，“除草剂耐受性”是指植物耐受除草剂并避免伤害的能力。
[0027]如本文所用，“回交”是指杂交子代与亲本之一反复回交的过程。
[0028]详述
[0029]本专利技术包括用于植物胚挽救的方法。该方法的步骤包括：a)在授粉后20天或更少的天数(“DAP”)时收获未成熟种子并将其灭菌；b)从步骤a的所述未成熟种子分离未成熟胚；c)培养步骤b的所述未成熟胚；以及d)在合适的生长培养基和条件中从步骤c的经培养的未成熟胚生长幼苗。所述方法的合适的生长培养基包括对健康的ER幼苗生长优化的蔗糖浓度、光周期和温度。
[0030]上述方法的植物是双子叶物种，并且在另一个实施方案中是向日葵。在所述方法中用于增强幼苗发育的所述未成熟胚的胚龄为授粉后10
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18天。在一个实施方案中，所述未成熟胚的胚龄为授粉后12天。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于植物胚挽救的方法，所述方法包括下列步骤：a.在授粉后20天或更少的天数(“DAP”)时收获未成熟种子；b.从步骤a的所述未成熟种子分离未成熟胚；c.培养步骤b的所述未成熟胚；以及d.在合适的生长培养基和条件中从步骤c的培养的未成熟胚生长幼苗；其中所述合适的生长培养基包括蔗糖浓度、光周期和温度。2.根据权利要求1所述的方法,其中步骤a的所述未成熟种子在乙醇或包含次氯酸盐和/或漂白剂的灭菌溶液中灭菌。3.根据权利要求1所述的方法,其中所述未成熟种子是双子叶物种。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述双子叶物种是向日葵。5.根据权利要求1所述的方法,其中用于增强幼苗发育的所述未成熟胚的胚龄为授粉后10
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18天。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述未成熟胚的胚龄为授粉后12天。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述未成熟胚的胚龄为授粉后14天。8.根据权利要求1所述的方法,其中用于胚生长的蔗糖浓度为15g/l
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30g/l。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述蔗糖浓度为20g/l。10.根据权利要求1所述的方法,其中用于胚生长的光周期为：(i)16小时昼/8小时夜，(ii)8小时昼/16小时夜,(iii)5天黑暗加以16小时昼/8小时夜持续两天，或(iv)3天黑暗加以16小时昼/8小时夜持续4天。11.根据权利要求10所述的方法，其中用于胚生长的光周期为3天黑暗加以16小时昼/8小时夜持续4天。12.根据权利要求10所述的方法，其中用于胚生长的光周期为16小时昼/8小时夜。13.根据权利要求1所述的方法,其中用于胚生长的温度为20℃
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30℃。14.根据权利要求13所述的方法,其中所述温度为25℃。15.植物、植物部分或其子代，其中所述植物、植物部分或其子代通过权利要求1所述的方法产生。16.一种使用权利要求1所述的胚挽救方法进行体外抗除草剂性状选择的方法，其中所述未成熟胚在包含除草剂的培养基上生长。17.根据权利要求16所述的方法,其中所述除草剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：但颖晖，M，
申请(专利权)人：先正达农作物保护股份公司，
类型：发明
国别省市：