一种亚铁螯合酶基因遗传变异诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种亚铁螯合酶基因遗传变异的诊断试剂盒，其中含有自主设计的引物，克服FECH基因中部分外显子较难扩增的问题，可以成功扩增得到FECH成熟蛋白编码区的外显子DNA基因序列以及其上下游含重要已知剪切位点的内含子区域，而且还可以检测到FECH的全长cDNA，达到了对FECH基因潜在致病区域的全面检测的目的。目的。

【技术实现步骤摘要】
一种亚铁螯合酶基因遗传变异诊断试剂盒


[0001]本专利技术涉及遗传代谢分子生物领域，具体涉及一种亚铁螯合酶基因遗传变异诊断试剂盒。

技术介绍

[0002]亚铁螯合酶基因(Ferrochelatase,FECH)突变导致的红细胞生成性原卟啉症(Erythropoietic protoporphyria，EPP)是一种罕见的遗传疾病，目前尚缺乏有效治疗手段，2019年FDA批准的首个药物Scenesse(afamelanotide,16mg)用于治疗红细胞生成性原卟啉症，但其作用也有限。而，早期诊断可以阻断这种疾病继续发展、预防严重的并发症，从而显著降低病死率。但现有的检测手段也极其有限，导致红细胞生成性原卟啉症的早期诊断率并不高，尚无法实现从早期介入治疗，以降低红细胞生成性原卟啉症病死率的效果。
[0003]通常通过检测FECH基因突变来确定存在EPP，但是EPP患者的亚铁螯合酶基因突变携带率极低，导致实际检出率更低。而且，该基因的遗传致病方式特殊，致病分子基础是反式共遗传(Trans
‑
co
‑
inheritance)，需要从FECH基因中检测到存在IVS3
‑
48位的T to C变异(IVS3
‑
48T/C)，而到目前为止，尚缺乏检测FECH致病内含子区域以及全外显子检测的有效试剂盒技术。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术提出一种亚铁螯合酶基因遗传变异诊断试剂盒。其包括扩增如下基因的引物：亚铁螯合酶基因的所有外显子和外显子上下游近侧50
‑
150bp的内含子区域，引物序列见下表：
[0005][0006][0007]优选地，本专利技术所提供的诊断试剂盒，还包括扩增亚铁螯合酶基因的全长cDNA的引物，引物序列见下表：
[0008][0009]与现有技术相比较，本专利技术的优势在于：
[0010]本专利技术解决了现有技术中缺乏对亚铁螯合酶基因(FECH)导致的疾病的早期诊断以及预防阻断的技术难题。本专利技术亚铁螯合酶基因遗传变异诊断试剂盒中含有自主设计的引物，克服FECH基因中部分外显子较难扩增的问题，可以成功扩增得到FECH成熟蛋白编码区的外显子DNA基因序列以及其上下游含重要已知剪切位点的内含子区域，而且还可以检测到FECH的转录本，达到了对FECH基因潜在致病区域的全面检测的目的，可以作为出现光敏、神经、血液、消化等系统相似症状需要鉴别诊断或家系筛查的红细胞生成性原卟啉症疑似患者的确认试剂盒，具有较广阔的应用前景。
附图说明
[0011]图1为本专利技术引物扩增后得到的扩增子的电泳图；
[0012]图2为样本扩增产物序列与国际公认参比序列NG 008175的对比图；
[0013]图3为样本1的含致病剪切位点的内含子片段与外显子内突变片段的图谱；
[0014]图4为样本2的含致病剪切位点的内含子片段与外显子内突变片段的图谱；
[0015]图5为样本3的含致病剪切位点的内含子片段与cDNA片段的图谱；
[0016]图6为样本3的含致病剪切位点的内含子片段与cDNA片段的图谱。
具体实施方式
[0017]下面结合附图及具体实施例，详细阐述本专利技术的优势。
[0018]本专利技术采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，利用自主研发
的引物，对全血样本进行扩增，以获得FECH基因的外显子及其上下游约50
‑
150bp的内含子，以及其全长cDNA，并根据这些外显子、内含子及cDNA基因进行判读，以确定样本是否存在亚铁螯合酶基因突变。本专利技术具体实施例中所采用的试剂及仪器如下所述：
[0019]1.试剂
[0020]德国QIAGEN公司的QIAamp Blood Mini试剂盒，货号：51106，250人份/盒，室温保存；
[0021]蛋白酶K，1瓶，4℃下保存；
[0022]Buffer
[0023]QIAGEN公司的AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒，货号：80204，50人份/盒，室温保存；
[0024]Promega公司的多聚酶，100U/支，－20℃保存；
[0025]TAKARA公司的dNTP Mixture各2.5mM，1.28ml/支，－20℃保存；
[0026]TAKARA公司的PrimeScript
TM
II 1
st Strand cDNA synthesis试剂盒，－20℃保存；
[0027]上海生工的琼脂糖，100克/瓶，室温保存；
[0028]TAKARA公司的DL2000 DNA Marker试剂盒，－20℃保存；
[0029]自主设计引物序列(见表1)。
[0030]表1.PCR引物及cDNA序列、扩增条件及扩增子长度
[0031][0032][0033]2、仪器
[0034]Eppendorf公司的Eppendorf 5415D离心机；
[0035]Thermo scientific公司的Nanodrop 2000分光光度计，；
[0036]ABI公司的ProFlex TM 3X 32孔PCR系统热循环仪，；
[0037]Bio
‑
Rad公司的Bio
‑
rad电泳仪；
[0038]Tanon公司的Tanon 3500凝胶成像系统。
[0039]3、检测条件及步骤
[0040]提取DNA
[0041]分别取待测EDTA抗凝全血标本200μl、蛋白酶K 20μl、Buffer AL 200μl，混合并振荡15秒，充分混匀后置于56℃的水浴中放置30分钟；加入无水乙醇(96～100％)200μl，振荡15秒，以10000转/分的频率在离心机中离心处理1分钟；将上述混合物移至QIAamp Spin Column中，以10000转/分的频率离心处理1分钟；更换收集管；加入Buffer AW1500μl，以10000转/分的频率离心处理1分钟；更换收集管；加入Buffer AW2 500μl，以12000转/分的频率离心处理3分钟，更换为1.5ml的离心管；加入Buffer AE 200μl，在室温下放置5分钟，以8000转/分的频率离心处理3分钟，得到基因组DNA，在4℃保存备用；用分光光度计定量抽提得到的基因组DNA的浓度。
[0042]提取RNA：
[0043]按照QIAGEN公司的AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒(货号：80204)的操作手册执行。
[0044]cDNA的合成
[0045]采用PrimeScript
TM
II 1st Strand cDNA synthesis试剂盒(Takara,Japan)，在
0.6ml的离心管中配制下列反应混合液：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚铁螯合酶基因遗传变异的诊断试剂盒，其特征在于，包括扩增如下基因的引物：亚铁螯合酶基因的所有外显子和外显子上下游近侧50
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【专利技术属性】
技术研发人员：韩悦，张欣欣，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：