杂交抗体制造技术

本文描述了靶向用于治疗癌症的杂交抗体。所述抗体对Fcε受体和新生儿Fc受体具有结合能力，这可以例如通过将IgE恒定结构域中的序列或氨基酸替换为源自IgG的相应序列和氨基酸来实现。来实现。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】杂交抗体
专利

[0001]本专利技术在于设计合成的(非天然存在的)杂交抗体，特别是杂交IgE抗体，以及它们的治疗用途。
[0002]专利技术背景
[0003]免疫球蛋白E(IgE)是仅在哺乳动物中发现的一类抗体(或免疫球蛋白(Ig)“亚型”)。IgE由浆细胞合成。与所有抗体类别一样，IgE的单体由两条较大的相同重链(ε链)和两条相同的轻链(其是所有抗体类别共有的)组成，其中ε链含有四个Ig样恒定结构域(Cε1
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Cε4)。
[0004]区分不同抗体类别的是重链的性质，其中IgE类别的重链与更常见的IgG类别的重链相比更大且糖基化程度更高。每条抗体链由一系列串联排列的免疫球蛋白结构域组成。N
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末端结构域(轻链和重链各一个)含有高度可变序列区域，其能够与大范围的抗原结合(可变结构域)。其余结构域由高度保守的所谓恒定(Fc)结构域组成。
[0005]IgE的一种功能是对寄生虫例如蠕虫产生免疫力。IgE在I型超敏反应中也有重要作用，I型超敏反应表现为各种过敏性疾病，例如过敏性哮喘、大多数类型的窦炎、过敏性鼻炎、食物过敏，以及特定类型的慢性荨麻疹和特应性皮炎。IgE在对过敏原的响应中也起着举足轻重的作用，例如：过敏性药物、蜜蜂叮咬和脱敏免疫疗法中使用的抗原制剂。
[0006]尽管IgE通常是最不丰富的亚型，正常(“非特应性”)个体中的IgE水平仅为Ig浓度的0.05％，相比之下，IgG为75％，浓度为10mg/ml，IgG是负责大多数经典的适应性免疫应答的亚型，并能够触发最强大的炎症反应。
[0007]IgG是在血液和细胞外液中发现的允许控制身体组织的感染的主要抗体类型。通过结合多种类型的病原体例如病毒、细菌和真菌，IgG可以保护身体免受感染。IgG抗体是由四条肽链组成的分子量为约150kDa的大分子。每个分子含有两条相同的约50kDa的γ类重链和两条相同的约25kDa的轻链，因此是四聚体四元结构。两条重链相互连接，并通过二硫键分别与一条轻链相连。得到的四聚体具有两个相同的一半，它们一起形成Y样形状。该叉状物的每一端都含有相同的抗原结合位点。
[0008]归因于效应细胞的多样性和与每个抗体类别的不同恒定结构域结合的因子，结构差异赋予抗体类别之间不同的生物活性。IgG的γ链与广泛的受体家族结合，包括经典的膜结合表面受体，以及非典型的细胞内受体和细胞质糖蛋白。膜结合表面受体包括FcγRI(CD64)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa(CD16)和FcγRIIIb的受体家族结合。类似地，IgE的ε链与高亲和力受体FcεRI和低亲和力受体FcεRII结合。这些不同受体在不同免疫效应细胞上的差异表达决定了IgG和IgE可以产生的免疫应答类型。
[0009]在非典型FcγR中，新生儿Fc受体(FcRn)因其对IgG生物学的密切影响及其还与白蛋白结合的能力而臭名昭著。FcRn起到再循环或转胞吞受体的功能，所述受体负责维持循环中的IgG和白蛋白，并双向运输这两种配体穿过极化的细胞屏障。还认识到，FcRn通过与源自IgG免疫复合物(IC)的肽相互作用并促进其抗原呈递而作为免疫受体起作用。
[0010]新生儿Fc受体(FcRn)属于广泛且功能上相异的MHC分子家族。与经典的MHC家族成
员相反，FcRn几乎没有多样性并且不能呈递抗原。相反，通过它在低pH值下以高亲和力结合IgG和白蛋白的能力，它调节这两种蛋白的血清半衰期。IgG的血清半衰期明显长于类似大小的球状蛋白，包括不与FcRn结合的IgE(IgG约为21天，IgE约为＜2天)。此外，FcRn通过其影响IgG寿命的能力以及其在先天性和适应性免疫应答中的参与，在粘膜和全身部位的免疫中起重要作用。
[0011]FcRn表达现在被认为是广泛存在的，在整个生命过程中都会发生，并且由许多不同物种中的多种多样的实质细胞类型表达。这些包括血管内皮(包括中枢神经系统)、大多数上皮细胞类型，例如胎盘(合体细胞滋养层)、表皮(角质形成细胞)、肠(肠上皮细胞)、肾小球(足细胞)、支气管、乳腺(导管和腺泡)、视网膜色素上皮细胞、肾近端肾小管细胞(PTC)、肝细胞、黑素细胞，以及眼中的内脉络膜、睫状体和虹膜的细胞。FcRn也在造血细胞中广泛表达，包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、嗜中性粒细胞和B细胞，其中，与极化上皮细胞相比，在细胞表面上检测到显著数量的FcRn(Zhu X等人(2001)J.Immunol.166(5)：3266
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76)。
[0012]在人的四种IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)中，对FcRn的结合亲和力范围为20nM(IgG1)至80nM(IgG4)(West AP Jr，Bjorkman PJ(2000)Biochemistry 39(32)：9698
‑
708)。结构研究已表明，在非平衡或平衡条件下，FcRn分别以1∶1或2∶1的化学计量比与IgG结合(Popov S.等人(1996)Mol.Immunol.33(6)：521
‑
30；S
á
nchez L.M.等人(1999)Biochemistry 38(29)：9471
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6)。FcRn以相同的亲和力独立地结合IgG同源二聚体的两个位点(Haberger M.等人(2015)mAbs 7：331
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43)，但已知2∶1复合物形成产生的亲合力效应对半衰期延长很重要。
[0013]生化和晶体学数据表明，在pH 6.0下结合后，FcRn和IgG都不会发生主要的构象变化。IgG4中被认为影响与FcRn结合的关键残基是Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。在IgG1中，Cγ2
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Cγ3铰链区中组氨酸残基的质子化使得能够进行结合(Martin W.L.等人(2001)Molecular Cell 7：867
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877)。由于它们的pKa，组氨酸残基在pH～6时被质子化，这允许与FcRn残基Glu115和Asp130的相互作用。随着pH增加到高于6，组氨酸质子化逐渐丧失，这解释了相互作用的pH依赖性(Oganesyan V.等人同上；Raghavan M.等人(1995)Biochemistry 34：14649
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57；Kim J.K.等人(1999)Eur J Immunol.29：2819
‑
2825)。这允许在FcRn
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Fc界面形成盐桥，特别是FcRn中α2结构域的C末端部分上的酸性残基(West等人同上，Martin等人同上，Vaughn DE，Bjorkman PJ.(1998)Structure 6：63
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73)。除了重链相互作用之外，β2m还通过Ile1残基与IgG形成接触(Shields R.L.等人(2001)J.Biol.Che本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种杂交抗体，其结合Fcε受体和新生儿Fc受体(FcRn)。2.根据权利要求1所述的杂交抗体，其包含源自IgE抗体的一个或多个重链恒定结构域或其变体或功能片段。3.根据权利要求1或权利要求2所述的杂交抗体，其至少包含Cε3结构域或其变体或功能片段。4.根据前述权利要求中任一项所述的杂交抗体，其至少包含Cε2、Cε3和Cε4结构域，或其变体或功能片段。5.根据前述权利要求中任一项所述的杂交抗体，其中所述抗体包含源自IgG抗体的FcRn结合位点的全部或部分，或其变体或功能片段。6.根据前述权利要求中任一项所述的杂交抗体，其中通过四聚体IgE的至少一个Fc结构域中的一个或多个氨基酸取代提供FcRn结合。7.根据权利要求6所述的杂交抗体，其包含：(i)在IgE的Cε3中的至少一个氨基酸取代；(ii)在IgE的Cε4中的至少一个氨基酸取代；和/或(iii)在IgE的Cε3中的一个氨基酸取代和Cε4中的两个氨基酸取代。8.根据权利要求6或权利要求7所述的杂交抗体，其中，IgE中的氨基酸取代包含IgG中相应位置存在的非天然组氨酸残基。9.根据前述权利要求中任一项所述的杂交抗体，其包含IgE抗体，所述IgE抗体包含赋予FcRn结合的一个、两个或三个异源组氨酸残基。10.根据权利要求6至9中任一项所述的杂交抗体，其中，IgE的Cε3的环2中的苏氨酸被取代为组氨酸。11.根据权利要求6至10中任一项所述的杂交抗体，其中，IgE的Cε4的环3中的丝氨酸被取代为组氨酸，并且谷氨酰胺被取代为组氨酸。12.根据前述权利要求中任一项所述的杂交抗体，其包含：(i)在78位包含组氨酸残基的变体IgE Cε3结构域；(ii)在95和/或98位包含组氨酸残基的变体IgE Cε4结构域。13.根据前述权利要求中任一项所述的杂交抗体，其包含：(i)IgE Cε3结构域，其与SEQ ID NO:2具有至少85％、90％、95％或99％的序列同一性并包含突变T78H；和/或(ii)IgE Cε4结构域，其与SEQ ID NO:3具有至少85％、90％、95％或99％的序列同一性，并且包含突变S95H和/或Q98H。14.根据前述权利要求中任一项所述的杂交抗体，其包含：(i)如SEQ ID NO:31所定义的IgE Cε3环序列；和/或(ii)如SEQ ID NO:32或33所定义的IgE Cε4环序列。15.根据前述权利要求中任一项所述的杂交抗体，其包含与SED ID NO:26具有至少85％、90％、95％或99％的序列同一性并且在SEQ ID NO:26的78、203和/或206位包含组氨酸残基的氨基酸序列。16.根据前述权利要求中任一项所述的杂交抗体，其中所述抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：艾普西洛根有限公司，
类型：发明
国别省市：