一种HBV感染的树鼩模型构建方法及树鼩模型技术

本发明专利技术涉及一种动物模型，公开了一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其具体包括对以下步骤：步骤S1、对细胞株分别进行复苏、传代培养及冻存；步骤S2、制取HBV培养液；步骤S3、进行HBV活性评估并筛选HBV培养液有效滴度；步骤S4、获取感染HBV的培养基；步骤S5、筛选出有效HBV上清液浓度；步骤S6、设置实验分组；步骤S7、构建动物模型并根据实验数据得到实验结论。本发明专利技术通过构建HBV感染的树鼩模型，能够有效解决因缺乏HBV稳定有效的动物模型，致使对HBV持续感染、致病机制研究及抗病毒药物的开发和评价的相对滞后等问题，对乙型肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝癌等疾病的进一步研究具有重大意义。及肝癌等疾病的进一步研究具有重大意义。及肝癌等疾病的进一步研究具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种HBV感染的树鼩模型构建方法及树鼩模型


[0001]本专利技术涉及一种动物模型的构建，尤其涉及了一种HBV感染的树鼩模型构建方法及树鼩模型。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是乙型肝炎的病原体，属嗜肝DNA病毒科，通过逆转录的方式进行自我复制，并受到病毒和宿主因子的精确调控。HBV感染肝细胞可引起急慢性肝炎，甚至是严重的肝硬化和肝癌等，估计全世界慢性感染该病毒的人数超过2.5亿，严重危机人类的生命安全。中国是HBV感染的高危地区，有近1亿HBV携带者，其中20％～30％患有肝硬化和肝癌等严重疾病，呈逐年递增趋势且中国HCC的发生率占世界的55％，约90％为乙肝肝炎相关的肝癌。HBV致病机制研究早已成研究热点，但该研究目前仍受到体内实验模型构建的限制。
[0003]自1965年至1979年国外相关学者研究发现HBV后正式予以命名，直至1988年国外学者才首次报道国HBV
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DNA基因分型，不同的毒株长期与环境间的突变进化，导致了A－H等8种分型。其中，HBV基因组包含4个相互重叠的开放读码框(Open reaading frame,ORF):preS/S、preC/C、P和X，SORF具有HBS，preS1和preS2基因，它们编码三种病毒包膜蛋白；P ORF编码病毒聚合酶(HBP)；C ORF包含负责病毒核心蛋白(HBC)和HBe蛋白表达的C和前核基因；X是编码HBV X蛋白(HBX)的最小ORF。ORF编码HBV各种蛋白包括：乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)、乙肝病毒核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)及乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B Xantigen,HBx)等，其中HBcAg及HBsAg属于结构蛋白，而HBx属于调控蛋白。这些蛋白调控宿主细胞增殖、侵袭、分化、表观遗传特征、染色质稳定等，而HBX通过调节多种宿主因子的表达和活性来调节肿瘤发生，被认为是癌症的辅助因子。同时，目前研究发现乙肝病毒中HBx蛋白可能与基因型C和原发性肝癌(HCC)的高发生率有一定相关性，并且可以不依赖肝硬化的发生。
[0004]目前研究发现，HBV
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DNA基因型不同，基因型的临床和病理特征也不同，基因型会影响慢性乙型病毒性肝炎的预后和抗病毒治疗的成功。目前慢性乙型病毒性肝炎已在亚洲的高流行人群中进行了深入研究，在亚洲HBV
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DNA基因型B和C基因型占主导地位，我国HBV
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DNA基因型C和B型为主。近期王超、刘超等学者进行临床研究表明，在HBV
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DNA基因型与肝癌及HBV
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DNA载量的相关性研究中，HBV C型在乙肝相关的肝癌患者中占有更高的比例和突变率，相较B型也有更高的突变率；在HBV
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DNA基因分型与HBV
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DNA载量的关系中B型HBV
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DNA载量水平明显低于C型和混合型。因此，进一步研究高致病亚型HBV感染，对乙肝临床治疗具有重大意义。
[0005]因HBV存在多亚型及突变情况，目前临床上尚未找到有效的治愈乙型肝炎的有效方法，加之乙型肝炎病程长，容易发展为肝硬化、肝癌，且早期肝癌无明显症状，以至于发现时已经达到晚期，失去最佳的手术时期。因此，急需完善相关体内外实验，进而明确HBV调控相关疾病的作用机制，对乙型肝炎实施有效的干预治疗。目前研究已发现，HepG2、Huh7、
HepG2.215等细胞可以通过转染HBV质粒建立体外模型[17
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18]，但HBV致病不仅受基因亚型影响，同时也因环境等变化而不同，因此需要进一步行体内实验研究，探索HBV的致病机制。在HBV感染机制研究过程中，由于缺乏有效的动物模型而无法深入开展相关体内实验，而建立稳定的HBV动物模型是促进病毒性肝炎、肝纤维化及肝癌研究的必经之路。
[0006]人类和少数灵长类动物是HBV的易感宿主,国外研究多采用与人类亲缘关系相近的长臂猿、黑猩猩等作为研究模型,进行HBV感染机制、疫苗研发、药物筛选等研究。但是大型灵长类动物多属保护物种,价格昂贵,实验周期长,操作难度大,因而难以推广。而树鼩(Tupaia belangeri)是一种小型低等灵长类动物,相较大鼠、小鼠等常用实验动物,其解剖结构、生理机能、生化代谢和基因序列等方面都与人类更相近,并且价廉易获得、体型小易操作,作为HBV实验动物模型,受到越来越多的关注和研究。较多研究发现，土拔鼠、鸭、转基因小鼠等乙型肝炎动物模型存在较大的局限性，其不能直接感染HBV,且该类动物模型的肝炎病毒与HBV依旧存在一定的差异,仍不能完全模拟HBV的病理过程。2013年李文辉等研究发现，NTCP是HBV入侵肝细胞最重要也是必须的受体，乙肝病毒表面包膜大蛋白可通过肝脏胆酸转运蛋白(NTCP,钠离子
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牛磺胆酸钠共转运多肽)关键受体结合区发生特异性结合,继而HBV入侵肝细胞，同时也观察到树鼩体内NTCP的表达。
[0007]目前HBV基因型较多，在环境等多因素的影响下，我国以B型和C型为主，所以在研究HBV感染时，高致病亚型HVB动物模型的构建更具有针对性，后期相关体内实验研究结果更接近国情，并对乙型肝炎、肝硬化及肝癌等疾病的进一步研究具有重大意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术针对现有技术中缺乏HBV稳定有效的动物模型，提供了一种HBV感染的树鼩模型构建方法及树鼩模型。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决：
[0010]一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其具体包括以下步骤：
[0011]步骤S1、对HepG 2.2.15细胞株、HepG 2细胞株及ITh 6.1细胞株分别进行复苏、传代培养及冻存；
[0012]步骤S2、采用胎牛血清培养基培养HepG 2.2.15细胞制取HBV培养液；
[0013]步骤S3、对步骤S2中制取的HBV培养液进行HBV活性评估并筛选HBV培养液有效滴度；
[0014]步骤S4、用有效滴度的HBV培养液配合胎牛血清培养基对ITh 6.1细胞进行培养，获取感染HBV的培养基；
[0015]步骤S5、在步骤S3筛选出的HBV培养液有效滴度基础上设置不同浓度的HBV上清液组，选取试验树鼩，根据体重，相同频次地经树试验鼩尾静脉注射，筛选出有效HBV上清液浓度；
[0016]步骤S6、设置实验分组：分别为实验观察组、长期实验观察组和对照组；
[0017]步骤S7、根据步骤S5筛选出的有效HBV上清液浓度，给实验观察组合长期实验观察组经树鼩尾静脉注射HBV上清液，给对照组经树鼩尾静脉注射无HBV上清液；
[0018]步骤S8、检测所有实验分组中树鼩均性HBV
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DNA拷贝量、肝功能，观察4
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其特征在于其具体包括以下步骤：步骤S1、对HepG 2.2.15细胞株、HepG 2细胞株及ITh 6.1细胞株分别进行复苏、传代培养及冻存；步骤S2、采用胎牛血清培养基培养HepG 2.2.15细胞制取HBV培养液；步骤S3、对步骤S2中制取的HBV培养液进行HBV活性评估并筛选HBV培养液有效滴度；步骤S4、用有效滴度的HBV培养液配合胎牛血清培养基对ITh 6.1细胞进行培养，获取感染HBV的培养基；步骤S5、在步骤S3筛选出的HBV培养液有效滴度基础上设置不同浓度的HBV上清液组，选取试验树鼩，根据体重，相同频次地经树试验鼩尾静脉注射，筛选出有效HBV上清液浓度；步骤S6、设置实验分组：分别为实验观察组、长期实验观察组和对照组；步骤S7、根据步骤S5筛选出的有效HBV上清液浓度，给实验观察组合长期实验观察组经树鼩尾静脉注射HBV上清液，给对照组经树鼩尾静脉注射无HBV上清液；步骤S8、检测所有实验分组中树鼩均性HBV
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DNA拷贝量、肝功能，观察4
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8周后，对实验观察组、对照组进行麻醉，经股静脉获取静脉血，随后开腹获取肝脏组织予固定液及保存液处理；步骤S9、对步骤S8中获取的静脉血进行检测，对肝脏组织进行处理，得到样本检测数据，通过统计方法进行分析，得出实验结论。2.根据权利要求1所述的一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其特征在于：所述的步骤S1中对细胞株进行复苏的方法具体包括以下步骤：步骤S11、将细胞株冻存管于液氮中取出后，快速置于37℃水浴锅中进行复苏；步骤S12、待细胞悬液完全融化后立即分装分别进行离心；步骤S13、离心结束后去除上清液，并反复清洗细胞，重复离心去上清步骤；步骤S14、将清洗后的细胞接种至含胎牛血清的完全培养基中，完善时间等标记后，置于培养箱中培养；步骤S15、第二天观察细胞贴壁情况、细胞活力检测及对复苏后细胞的生长形态进行观察。3.根据权利要求2所述的一种HBV感染的树鼩模型构建方法，其特征在于：所述的步骤S1中对细胞株进行传代培养的方法具体包括以下步骤：步骤S16、当细胞培养瓶培养细胞覆盖率80％
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90％时，弃去培养基并用PBS润洗后予胰蛋白酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：李立，胡宗强，尹燕锋，颜春涛，江杰，王依婷，马丽，
申请(专利权)人：昆明市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：