本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及用于检测西瓜全缘叶形的SNP位点、紧密连锁分子标记及应用。本发明专利技术的分子标记能够从分子水平鉴定西瓜叶形性状，可以直接用于西瓜全缘叶形材料的分子标记辅助育种，提高育种的选择效率，加快育种进程；另外利用该分子标记可获得这两分子标记之间的物理图谱，从而为最终西瓜全缘叶形ClLL基因的克隆、分子标记辅助育种体系的建立奠定基础，同时也为西瓜叶片发育调控网络的研究奠定基础。网络的研究奠定基础。网络的研究奠定基础。
SNP sites, closely linked molecular markers and their applications for detecting the whole leaf shape of watermelon
【技术实现步骤摘要】
用于检测西瓜全缘叶形的SNP位点、紧密连锁分子标记及应用
[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一对用于定位西瓜全缘叶形基因ClLL的、与西瓜全缘叶形基因ClLL紧密连锁的分子标记、用于检测西瓜全缘叶形的SNP位点以及应用。
技术介绍
[0002]选择是育种中最重要的环节之一，它是指在一个群体中选择符合要求的基因型来进行后续的培育。然而在传统的育种过程中，选择的依据往往是通过植株的表现型来判定，这种选择往往耗时较长且可能与基因型有偏差，造成选择不够准确并且效率低下。而利用分子标记辅助育种可以快速检测到目标基因或与目标性状紧密连锁的位点，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。
[0003]dCAPS(衍生形酶切扩增多态性序列)标记是在CAPS(酶切扩增多态性序列)标记的基础上改进而来的。其基本原理为：在设计提议性的扩增引物时引入错配的碱基，使其可以产生新的限制性内切酶作用位点，之后用该引物进行PCR扩增，将获得的扩增产物用特定的限制性内切酶进行酶切，最后采用凝胶电泳进行酶切片段检测，根据是否切开来判断样品间的多态性。dCAPS标记是共显性标记，可区分杂合和纯合的基因型，可以直接用琼脂糖电泳分析，操作简便快捷。dCAPS标记相对于CAPS标记不需要考虑SNP是否在限制性内切酶位点上，可以最大限度的将SNP转化成标记，使基因组上的SNP的利用率更高。无法转化成dCAPS标记的SNP位点，可以设计引物通过sanger法测序的方式对其所在DNA链上相对位置碱基进行检测判断样品间的多态性。
[0004]作为一种重要的葫芦科作物，西瓜是人们夏季消暑解渴的重要水果，其在世界园艺作物中占有非常重要的地位。而中国作为世界上西瓜生产和消费第一大国，栽培面积及产量巨大。叶片是开花植物极其重要的光合器官，决定着营养物质的分配、气体交换和水分运输，植物叶片的形状同时影响光合效率和蒸腾速率，是影响植物体内物质积累关键因素，从而影响植株的产量以及果实的品质。
[0005]叶片是由茎尖分生组织SAM周围一团未经分化的细胞经过分裂分化最终发育形成叶片。在整个叶片发育周期中受外界环境(温度、光照等)、体内激素(CK、IAA等)、转录因子(PIN1、KNOX1、WUS、CLV、ARP等)、miRNA等多因素影响。
[0006]叶片形态多样性的主要因素之一即为叶缘形状的变化，植物叶缘的形状多种多样，主要包含波浪、锯齿、全缘、裂刻等，而在传统上将叶分为单叶和复叶两大类，复叶和单叶均可分为浅裂、深裂和全缘，复叶可看作是极端类型的单叶叶缘深裂。叶片的发育机理和模式是目前研究的热点。HD
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zipI亚家族转录因子在许多植物中保守以调节叶片形状，lmil最早在拟南芥中被报道为花调节剂，并被发现影响叶片形态建成，拟南芥中组成性表达同源基因产生了裂叶。目前发现在其它物种中类lmi1的基因的功能是相似的，影响植物叶片最终形状。全缘叶形性状是西瓜品种多样性的表现，同时叶片面积大小和叶片形状均会对植物产量和品质造成一定影响，因此关于叶片发育分子机理的研究自然成为国内外科学家
关注的焦点之一。
[0007]随着西瓜全基因组测序的完成，近年来关于西瓜的相关研究发展迅速，许多优异的性状已经进行了基因定位，开发出的一些连锁标记也已经开始用到分子标记辅助育种过程当中，而目前关于西瓜全缘叶形的紧密连锁的分子标记研究还未见报道。通过对西瓜全缘叶形的研究，开发出和西瓜全缘叶形性状紧密连锁的分子标记，不仅可以为西瓜分子标记辅助选择培育全缘叶形西瓜新品种提供有效的帮助，同时也可以大大缩短育种进程并提高选择的准确性。
技术实现思路
[0008]本专利技术的目的之一是提供两对用于定位西瓜全缘叶基因ClLL并且与西瓜全缘叶基因ClLL紧密连锁的分子标记。
[0009]本专利技术目的之二在于提供了一个用于检测西瓜全缘叶形的SNP位点以及其分子标记引物，所述SNP位点为西瓜基因组(http：//cucurbitgenomics.org/，VI)4号染色体上，第21233133位核苷酸T缺失。
[0010]本专利技术目的之三在于提供一种上述分子标记在西瓜分子育种的应用。
[0011]本专利技术的另一目的在于提供一种西瓜全缘叶形品种的判定方法。
[0012]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0013]与西瓜植株全缘叶形基因ClLL紧密连锁的两对分子标记，该分子标记为衍生形酶切扩增多态性标记(dCAPS标记)，与西瓜全缘叶形紧密连锁的衍生形酶切扩增多态性分子标记是基于ClLL开发的，两对分子标记命名为dCAPS2和dCAPS3，扩增所述的dCAPS2分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.2所示；扩增所述的dCAPS3分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.3所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.4所示。。
[0014]本专利技术还公开了与西瓜全缘叶形基因ClLL紧密连锁的分子标记在西瓜分子育种的应用，该分子标记与西瓜全缘叶形性状紧密连锁，在分子水平上可以辅助鉴定西瓜植株是否为全缘叶形的表型，并且在种子或者苗期即可判定西瓜叶形性状，从而提高选择效率、加快育种进程。本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本专利技术的分子标记来筛选全缘叶形西瓜品种。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述的本专利技术的分子标记的引物对，所述检测还可以通过测序方法进行。
[0015]本专利技术还公开了一种鉴定全缘叶形西瓜性状的方法，采用PCR扩增后酶切的方法进行检测，所述方法包括如下步骤：
[0016](1)提取西瓜组织的DNA；
[0017](2)PCR扩增：利用权利要求1所述的引物对，对步骤(1)所提取样品进行PCR扩增；
[0018](3)对步骤(2)中的扩增产物进行酶切处理，之后进行电泳检测；
[0019](4)根据步骤(3)的电泳条带结果进行判定，具体标准为：
[0020]对于分子标记dCAPS2，如果酶切产物为长度122bp的特征条带，则待测植株为全缘叶形的西瓜材料；如果酶切扩增产物为146bp的特征条带，该待测植株为纯合裂刻叶形的西瓜材料，如果酶切产物为两条长度分别为146bp、122bp的特征条带，该待测植株为杂合裂刻叶形的西瓜材料；对于分子标记dCAPS3，如果酶切产物为长度119bp的特征条带，则待测植
株为全缘叶形的西瓜材料；如果酶切扩增产物为89bp的特征条带，该待测植株为纯合裂刻叶形的西瓜材料，如果酶切产物为两条长度分别为119bp、89bp的特征条带，该待测植株为杂合裂刻叶形的西瓜材料。
[0021]具体地，所述PCR扩增的反应体系为：DNA 1μL、2
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PCR Mix 5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、灭菌蒸馏水3μL，总体积10μL。PCR扩增条件为：95℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、50s本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.与西瓜全缘叶形基因ClLL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记命名为dCAPS2和/或dCAPS3，扩增dCAPS2分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.2所示；扩增dCAPS3分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.3所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.4所示。2.权利要求1所述与西瓜全缘叶形基因ClLL紧密连锁的分子标记在西瓜分子育种中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分子标记用于鉴定或辅助鉴定西瓜全缘叶形性状。4.一种鉴定西瓜全缘叶形性状的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)提取西瓜植株组织的DNA；(2)PCR扩增：利用权利要求1所述的引物对，对步骤(1)所提取样品进行PCR扩增；(3)对步骤(2)中的扩增产物进行酶切处理，之后进行电泳检测；(4)根据步骤(3)的电泳条带结果进行判定，具体标准为：对于分子标记dCAPS2，如果酶切产物为长度122bp的特征条带，则待测西瓜植株为全缘叶形的西瓜材料，如果酶切扩增产物为146bp的特征条带，该待测西瓜植株为纯合裂刻叶形的西瓜材料，如果酶切产物为两条长度分别为146bp、122bp的特征条带，该待测西瓜植株为杂合裂刻叶形的西瓜材料；对于分子标记dCAPS3，如果酶切产物为长度119bp的特征条带，则待测西瓜植株为全缘叶形的西瓜材料，如果酶切扩增产物为89bp的特征条带，该待测西瓜植株为纯合裂刻叶形的西瓜材料，如果酶切产物为两条长度分别为119bp、89bp的特征条带，该待测西瓜植株为杂合裂刻叶形的西瓜材料。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系为：DNA 1μL、2
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PCR Mix 5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、灭菌蒸馏水3μL，总体积10μL；PCR扩增条件为：95℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、50s，共35个循环；72℃、10m...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨路明，豆峻岭，杨森，朱华玉，刘东明，牛欢欢，段世享，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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