一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法，包括步骤：从样本中提取蛋白；蛋白酶解获得多肽；半乳糖和N

【技术实现步骤摘要】
一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法


[0001]本专利技术属于生物分子分析试剂
，具体涉及固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析(SPTAgE)的方法。

技术介绍

[0002]T抗原是半乳糖通过β(1
‑
3)连接与乙酰半乳糖胺结合形成的二糖结构，属于常见O
‑
聚糖中的核心1结构。人体90％的癌症类型中都能检测到T抗原的表达。在正常细胞中T抗原是隐藏起来的，但在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和膀胱癌中会选择性暴露在癌细胞表面。T抗原是一种截短的O
‑
聚糖，体积小结构简单。它在人体中具有非生理性聚糖结构，因此它可被免疫系统识别为外来物。大多数癌症患者的T抗原测试可以在任何活检发现癌症之前被检测到。由于T抗原是血液和皮肤细胞表面的蛋白质，可以被免疫系统抗体识别，因此可以作为诊断或预后的疾病生物标志物。然而很少有方法可用于详细鉴定癌症中完整蛋白质被T抗原修饰，尤其是在早期阶段；同时与T抗原结构类似的核心8结构会干扰对T抗原修饰位点信息的获取。
[0003]因此，有必要研发一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法来特异性鉴定T抗原修饰位点及其相关糖蛋白。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的是提供一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析(SPTAgE)的方法，同时可区别核心2和核心8O
‑
糖基化糖蛋白或糖肽，以解决现有技术中鉴定T抗原糖基化位点及富集相关糖蛋白的难题。
[0005]本专利技术的一种技术方案是：
[0006]一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法，包括步骤：
[0007](1)从样本中提取蛋白；
[0008](2)蛋白酶解获得多肽；
[0009](3)半乳糖和N
‑
乙酰半乳糖氧化；
[0010](4)酰肼树脂固定与PNGase F酶切；
[0011](5)半乳糖苷酶处理与质谱分析。
[0012]进一步的，在步骤(1)中，所述样本包括：组织样本或体液样本。
[0013]进一步的，在步骤(2)中，所述蛋白酶解获得多肽包括：
[0014]①
向蛋白溶液中加入二硫苏糖醇，在温度为37℃的条件下反应1
‑
1.5小时；
[0015]②
再加入碘乙酰胺，室温暗室反应0.5
‑
1小时，获得样本；
[0016]③
将所述样本稀释，加入碳酸氢铵，直至所述碳酸氢铵的终浓度为90
‑
110mM，所述样本的pH值介于7
‑
9之间；
[0017]④
加入测序级胰蛋白酶，轻微振荡，在温度为37℃的条件下水解16
‑
18小时，得到多肽溶液；
[0018]⑤
在所述多肽溶液中加入甲酸，直至pH值下调至2
‑
3；
[0019]⑥
将C18萃取柱预处理，向所述C18萃取柱中加入所述多肽溶液，将过滤液再次加入所述C18萃取柱，用0.1％TFA清洗所述C18萃取柱多次，最后，用含有0.1％TFA的50
‑
60％乙腈洗脱出多肽，并且重复多次；
[0020]⑦
将洗脱出的多肽合并，真空冷冻干燥得到纯化的多肽。
[0021]进一步的，在步骤(3)中，所述半乳糖和N
‑
乙酰半乳糖氧化包括：向所述纯化的多肽中加入二甲基亚砜、磷酸钠缓冲液、辣根过氧化物酶以及半乳糖氧化酶，然后在温度为35℃的条件下反应0.9
‑
1.1小时，获得糖肽。
[0022]进一步的，所述二甲基亚砜、磷酸钠缓冲液、辣根过氧化物酶以及半乳糖氧化酶的体积比为9
‑
11：22
‑
23：12
‑
13：4
‑
6。
[0023]进一步的，在步骤(4)中，所述酰肼树脂固定与PNGase F酶切包括：所述糖肽与酰肼树脂进行共价结合，再加入PNGase F酶，在温度为37℃的条件下反应3小时后除去上清液，清洗获得树脂。
[0024]进一步的，在步骤(5)中，所述半乳糖苷酶处理包括：
[0025]①
向所述树脂中加入去离子水、50
‑
60mM磷酸钠缓冲液和β半乳糖苷酶，在温度为37℃的条件下反应1小时，以切断T抗原中半乳糖和乙酰半乳糖胺之间的连接，获得含T抗原和核心2修饰位点的多肽。
[0026]进一步的，在步骤(5)中，所述半乳糖苷酶处理还包括：
[0027]②
向β半乳糖苷酶处理后的树脂中加入α半乳糖苷酶，以切断半乳糖
‑
α(1
‑
3)
‑
乙酰半乳糖胺中半乳糖和乙酰半乳糖胺的连接，得到含核心8的多肽。
[0028]进一步的，所述去离子水、磷酸钠缓冲液和β半乳糖苷酶的体积比为156
‑
160：38
‑
42：1.8
‑
2.2。
[0029]进一步的，在步骤(5)中，所述质谱分析包括：将含T抗原和核心2修饰位点的多肽和含核心8的多肽分别用液相色谱
‑
质谱分析，获得一级和二级质谱，用生物信息学软件解析质谱数据，获得位点信息。
[0030]本专利技术提供了一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法，能从复杂的蛋白多肽中，特异性富集分析T抗原修饰的糖肽，在下列各种场景(包括但不仅限于这些场景)有广泛应用：正常细胞和癌细胞中T抗原修饰的定性和定量分析；临床体液和组织中T抗原修饰的定性和定量分析；完整T抗原修饰的糖肽的定性定量分析，所以本方法可以富集并区分含T抗原、核心2和核心8的糖肽，对发现肿瘤组织和体液中具有T抗原修饰的特异性标志物，以及癌症早期诊断和预后标志物的研究等方面有着重要意义。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，
[0032]图1为本专利技术中富集含T抗原修饰的糖肽的工作流程示意图；
[0033]图2为本专利技术中蛋白质酶解并通过半乳糖氧化酶(GAO)氧化糖肽示意图；
[0034]图3为本专利技术中半乳糖氧化酶(GAO)对半乳糖和N
‑
乙酰半乳糖的氧化原理示意图；
[0035]图4为本专利技术中氧化的半乳糖和N
‑
乙酰半乳糖糖肽与酰肼树脂的共价结合过程示意图；
[0036]图5为本专利技术中T抗原糖肽固相酶富集制备示意图。
具体实施方式
[0037]本专利技术开发了一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析(SPTAgE)的方法，包括如下步骤：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法，其特征在于，包括步骤：(1)从样本中提取蛋白；(2)蛋白酶解获得多肽；(3)半乳糖和N
‑
乙酰半乳糖氧化；(4)酰肼树脂固定与PNGase F酶切；(5)半乳糖苷酶处理与质谱分析。2.根据权利要求1所述的一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述样本包括：组织样本或体液样本。3.根据权利要求1所述的一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述蛋白酶解获得多肽包括：
①
向蛋白溶液中加入二硫苏糖醇，在温度为37℃的条件下反应1
‑
1.5小时；
②
再加入碘乙酰胺，室温暗室反应0.5
‑
1小时，获得样本；
③
将所述样本稀释，加入碳酸氢铵，直至所述碳酸氢铵的终浓度为90
‑
110mM，所述样本的pH值介于7
‑
9之间；
④
加入测序级胰蛋白酶，轻微振荡，在温度为37℃的条件下水解16
‑
18小时，得到多肽溶液；
⑤
在所述多肽溶液中加入甲酸，直至pH值下调至2
‑
3；
⑥
将C18萃取柱预处理，向所述C18萃取柱中加入所述多肽溶液，将过滤液再次加入所述C18萃取柱，用0.1％TFA清洗所述C18萃取柱多次，最后，用含有0.1％TFA的50
‑
60％乙腈洗脱出多肽，并且重复多次；
⑦
将洗脱出的多肽合并，真空冷冻干燥得到纯化的多肽。4.根据权利要求3所述的一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述半乳糖和N
‑
乙酰半乳糖氧化包括：向所述纯化的多肽中加入二甲基亚砜、磷酸钠缓冲液、辣根过氧化物酶以及半乳糖氧化酶，然后在温度为35℃的条件下反应0.9
‑
1.1小时，获得糖肽。...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨霜，徐明明，岳爽，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：