一种检测转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的方法，利用柱前衍生

【技术实现步骤摘要】
一种检测转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的方法


[0001]本专利技术涉及一种检测转基因大豆中草甘膦及其主要代谢物氨甲基膦酸残留的方法，属于农产品检测


技术介绍

[0002]大豆是一种含有丰富优质蛋白的豆科植物，具有较高的营养价值，是人类日常饮食中蛋白质的重要来源之一。受传统的饮食习惯影响，大豆油也是人们日常生活必需品。国内普通大豆供不应求，因此需要从海外进口大量的转基因大豆来满足市场需求，我国也因此成为全球转基因进口量和压榨量最大的国家。
[0003]转基因大豆是通过基因工程技术将外源基因(人工分离或进行修饰后的基因)与普通大豆的基因组DNA进行重组并表达，从而对大豆的表达性状进行改造。因其高产、耐除草剂和抗病虫害等特点被广泛种植。抗草甘膦转基因大豆是目前全球种植面积最大的大豆品种。草甘膦是一种高效、广谱、易降解的有机除草剂。虽对哺乳动物的毒性相对较低，但随着使用量的增加，草甘膦暴露出对雄性哺乳动物有显著的生殖毒性，主要通过雄性生殖激素的分泌和代谢水平，从而干扰和破坏生殖细胞和生殖器官的形成，导致精子数量减少和质量降低，造成不孕不育。草甘膦的主要代谢物氨甲基膦酸则会干扰DNA正常复制，染色体异常，增加人们的患癌几率。“美国草甘膦致癌”、“许昌草甘膦泄露”等事件的发生，引发了人们抗草甘膦转基因大豆中草甘膦及其主要代谢物氨甲基膦酸的残留问题的高度关注。
[0004]目前，检测草甘膦的方法主要有分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱
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质谱联用法、液相色谱
‑<br/>质谱联用法、离子色谱法、毛细管电泳法等。分光光度法虽然操作简单，但灵敏度不高，易受其他离子干扰。离子色谱法只适用于水样等简单基质。气相色谱法和气相色谱
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质谱联用法要将目标物转为可气化物质，需使用较多试剂，过程复杂，耗时过长。使用液相色谱法和液相色谱
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质谱联用法时，若直接提取后上机检测，受基质干扰影响较大，灵敏度不高。柱前衍生
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液质联用法是近几年来检测草甘膦和氨甲基膦酸的常用方法，国内外已有较多关于柱前衍生
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液质联用法检测草甘膦的报道，且主要针对于水、土壤、茶叶、稻米等基质，针对转基因大豆的研究报道相对较少。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种检测转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的方法，本专利技术建立了一种利用柱前衍生
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UPLC
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MS/MS
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内标法测定转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的检测方法；采用UPLC
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MS/MS，在电喷雾电离(ESI
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)和多反应监测模式下测定，用同位素内标法进行定量分析，实现对转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸的快速分离和准确定性定量。本方法灵敏度高、回收率好、定性能力强、分辨率高，且前处理过程操作简单，能满足在线自动化检测的要求，从而达到绿色、高效、准确定性定量分析的目的。本方法操作简单、耗时较短、提取率好，更有效降低复杂基质成分的干扰、检出限低，适用于转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的日常检测工作。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种检测转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的方法，包括以下步骤：
[0008](1)配置标准品：
[0009]移取草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液于容量瓶中用纯水定容后得到混合标准储备液，然后利用纯水逐级稀释混合标准储备液，得到浓度逐级变化的混合标准溶液系列；
[0010](2)样品提取、净化和衍生：
[0011]将待测的转基因大豆样品均质化处理得到均质，向大豆均质中加入同位素内标溶液，依次使用盐酸
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水溶液和草甘膦检测基质方法包提取、二氯甲烷脱脂、超声提取和离心，取上清液过RM净化柱后得到净化液；取所得净化液加入四硼酸钠水溶液和FMOC
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Cl乙腈溶液，摇匀，密封，衍生，过有机滤膜得到待测液，待上机检测；
[0012](3)测定分析混合标准溶液系列：
[0013]将步骤(1)中得到的混合标准储备液进行色谱分离、质谱测定分析，得到草甘膦和氨甲基膦酸的保留时间、特征离子和离子碎片质量色谱图；将步骤(1)中的到的浓度逐级变化的系列混合标准溶液，按步骤(2)中的衍生法进行衍生后，采用UPLC
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MS/MS以步骤(3)的仪器条件进行测定分析，以同位素1,2
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C13N15草甘膦作为内标物进行定量，以定量离子与同位素内标峰面积比值为纵坐标(Y)，质量浓度与内标浓度比值为横坐标(X，ng/ml)绘制标准工作曲线；
[0014](4)定性定量转基因大豆样品中草甘膦和氨甲基膦酸：
[0015]将步骤(2)中到的转基因大豆样品的待测液，按照步骤(3)中的条件进行色谱分离、质谱测定分析，得到转基因大豆样品的色谱图和峰面积，与步骤(3)中的质量色谱图进行匹配分析且带入标准曲线进行计算，通过内标法能够定性、定量分析测定出转基因大豆样品中的草甘膦和氨甲基膦酸。
[0016]上述技术方案中，步骤(1)中，所述的草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液，质量浓度为1000mg/L，称取相同质量的草甘膦和氨甲基膦酸后用纯水溶解制备而成的。
[0017]上述技术方案中，步骤(1)中，准确移取草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用纯水定容至100ml，制备成10mg/L的混合标准储备液，于4℃下储存备用。
[0018]上述技术方案中，步骤(1)中，所述的混合标准溶液系列，逐级变化的浓度为1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。
[0019]上述技术方案中，步骤(2)中，所述的均质化处理，操作步骤为：将大豆是置于粉碎机粉碎，过60目筛得到质化后的转基因大豆样品，需精准称取2.00g均质化后的转基因大豆样品进行样品提取。
[0020]上述技术方案中，步骤(2)中，所述的同位素内标溶液为同位素1,2
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C13N15草甘膦内标溶液，浓度为1μg/mL，用量为50μL。
[0021]上述技术方案中，步骤(2)中，所述的盐酸
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水溶液提取，操作步骤为：向体系中加入10ml盐酸
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水溶液，涡旋混合1min、涡旋转速为2000rpm；所述的盐酸
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水溶液为0.1％盐酸溶液。
[0022]上述技术方案中，步骤(2)中，所述的草甘膦检测基质方法包提取，操作步骤为：向体系中加入100mg草甘膦检测基质方法包，涡旋混合1min、涡旋转速为2000rpm。所述的基质
缓冲包为草甘膦检测基质方法包。
[0023]上述技术方案中，步骤(2)中，所述的二氯甲烷脱脂，操作步骤为：向体系中加入10ml本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配置标准品：移取草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液于容量瓶中用纯水定容后得到混合标准储备液，然后利用纯水逐级稀释混合标准储备液，得到浓度逐级变化的混合标准溶液系列；(2)样品提取、净化和衍生：将待测的转基因大豆样品均质化处理得到均质，向大豆均质中加入同位素内标溶液，依次使用盐酸
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水溶液和草甘膦检测基质方法包提取、二氯甲烷脱脂、超声提取和离心，取上清液过RM净化柱后得到净化液；取所得净化液加入四硼酸钠水溶液和FMOC
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Cl乙腈溶液，摇匀，密封，衍生，过有机滤膜得到待测液，待上机检测；(3)测定分析混合标准溶液系列：将步骤(1)中得到的混合标准储备液进行色谱分离、质谱测定分析，得到草甘膦和氨甲基膦酸的保留时间、特征离子和离子碎片质量色谱图；将步骤(1)中的到的浓度逐级变化的系列混合标准溶液，按步骤(2)中的衍生法进行衍生后，采用UPLC
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MS/MS以步骤(3)的仪器条件进行测定分析，以同位素1,2
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C13N15草甘膦作为内标物进行定量，以定量离子与同位素内标峰面积比值为纵坐标(Y)，质量浓度与内标浓度比值为横坐标(X，ng/ml)绘制标准工作曲线；(4)定性定量转基因大豆样品中草甘膦和氨甲基膦酸：将步骤(2)中到的转基因大豆样品的待测液，按照步骤(3)中的条件进行色谱分离、质谱测定分析，得到转基因大豆样品的色谱图和峰面积，与步骤(3)中的质量色谱图进行匹配分析且带入标准曲线进行计算，通过内标法能够定性、定量分析测定出转基因大豆样品中的草甘膦和氨甲基膦酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液，质量浓度为1000mg/L，称取相同质量的草甘膦和氨甲基膦酸后用纯水溶解制备而成的；准确移取草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用纯水定容至100ml，制备成10mg/L的混合标准储备液，于4℃下储存备用；所述的混合标准溶液系列，逐级变化的浓度为1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的均质化处理，操作步骤为：将大豆是置于粉碎机粉碎，过60目筛得到质化后的转基因大豆样品；精准称取2.00g均质化后的转基因大豆样品后加入50μL浓度为1μg/mL的同位素内标溶液；所述的同位素内标溶液为同位素1,2
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C13N15草甘膦内标溶液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：君辉，沈飚，
申请(专利权)人：舟山海关综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：