一种检测心脑血管多种疾病易感基因的多重PCR特异性引物组、试剂盒、方法及应用技术

一种检测心脑血管多种疾病易感基因的多重PCR特异性引物组、试剂盒、方法及应用，其特征在于：该引物组包括207对特异性引物，分成两个Pool，Pool

A multiplex PCR specific primer set, kit, method and application for detecting susceptibility genes of cardiovascular and cerebrovascular diseases

【技术实现步骤摘要】
一种检测心脑血管多种疾病易感基因的多重PCR特异性引物组、试剂盒、方法及应用


[0001]本专利技术属于生物分子检测
，尤其涉及用于一种检测心脑血管多种疾病易感基因的多重PCR特异性引物组、试剂盒、方法及应用。

技术介绍

[0002]心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病。中国心血管病患病率处于持续上升阶段。推算心血管病现患人数3.30亿，其中脑卒中1300万，冠心病1100万，肺原性心脏病500万，心力衰竭890万，风湿性心脏病250万，先天性心脏病200万，下肢动脉疾病4530万，高血压2.45亿。2016年心血管病死亡率仍居首位，高于肿瘤及其他疾病，每5例死亡中就有2例死于心血管病，且农村高于城市。2016年农村心血管病死亡率为309.33/10万，其中心脏病死亡率为151.18/10万；城市心血管病死亡率为265.11/10万，其中心脏病死亡率为138.70/10万。
[0003]大量研究结果表明，部分人群中携带着某些疾病易感基因，当这些易感人群接触某些不良因子和不良环境时，其疾病发生几率比不携带疾病易感基因的人群要高好几十倍到几千倍。基因检测是通过血液、口腔拭子对DNA进行检测的技术，是取被检测者脱落的口腔黏膜细胞或其他组织细胞，扩增其基因信息后，通过基因检测设备对被检测者细胞中的DNA序列进行检测，通过分析基因组列序列得出患疾病风险。
[0004]一代测序“PCR+测序”的方法是分子检测的金标准。可以针对易感基因目的区域设计引物并进行PCR扩增，之后对目的区域进行测序得到结果；然而该技术费时费力，通量低价格高，从而限制了其临床应用。生物芯片作为高通量检测技术的代表，以其高通量、操作简单及其成本优势成为多靶点检测的重要技术选择之一。但是该方法包含的基因和位点数量有限，只能检测已知变异。飞行时间质谱法具有较高的通量，每台仪器单日可检测3000例样本，可检测位点多、并且高效准确，但对人员技术和检测样品纯度要求高，并且仪器昂贵，不适合在一般的医疗机构开展，限制了其广泛应用。事实证明，下一代测序(NGS)的易感基因位点检测方面具有强大的功能。多重PCR可同时扩增同一反应管中的多个区域，从而显著节省时间和试剂，并提供更准确的诊断信息。
[0005]而如何利用二代测序作为技术平台，设计合适的用于心脑血管多种疾病易感基因检测的引物组和试剂盒，并且能够实现有效提高检测效率、准确率，同时降低成本，一次检测，心脑血管疾病全覆盖的技术效果，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]本申请针对现有技术，提供一种能提高检测效率、降低成本、并且能够全面化的检测心脑血管多种疾病易感基因的用于检测心脑血管多种疾病易感基因的多重PCR特异性引
物组。
[0007]为了解决上述技术问题，本申请采用的技术方案为：一种用于检测心脑血管多种疾病易感基因的多重PCR特异性引物组，包括207对特异性引物，分成两个Pool，Pool
‑
1包含100对引物(具体的位点编号为1
‑
100)，核酸序列如SEQ ID:P 1
‑
200所示；Pool
‑
2包含107对引物(具体的位点编号为101
‑
207)，核酸序列如SEQ ID:P 201
‑
414所示。
[0008]进一步的，所述的多种疾病为10种，具体为高血压、冠心病、脑卒中、静脉栓塞、心肌梗塞、扩张性心肌病、房颤、心源性猝死、心律失常、血脂异常。
[0009]进一步的，本申请所述的207对特异性引物分别对应的检测位点如下表1所示：
[0010]表1各基因位点引物序列
[0011][0012][0013][0014][0015][0016][0017][0018][0019][0020][0021][0022][0023][0024][0025][0026]进一步的，在引物设计时，每对引物之间的退火温度差异小于2摄氏度，扩增产物长度在200
‑
300bp之间。
[0027]本申请还提供一种高通量测序文库构建的试剂盒，该试剂盒含有本申请上述207对特异性引物中的至少一对。
[0028]进一步的，本申请的所述的高通量测序文库构建的试剂盒，该试剂盒含有本申请上述207对特异性引物、Index、酶混合物、PCR Enhancer、无核酸酶水。
[0029]进一步的，本申请所述的高通量测序文库构建的试剂盒，其中还可以包括质控品和空白质控品，其中的质控品为正常人基因组DNA，空白质控品为无核酸酶水。
[0030]更进一步的，本申请所述的高通量测序文库构建的试剂盒，试剂盒的具体组分如下表2所示：
[0031]表2高通量测序文库构建的试剂盒组分
[0032][0033]本申请还提供一种基于多重PCR和高通量测序技术检测基因多态性位点的方法，该方法包括：
[0034](1)待检测的核酸提取及质控；
[0035](2)用特异性引物组及试剂盒中的其他试剂配制PCR反应体系，按照PCR扩增程序对所提取的DNA的目标区域进行PCR扩增，备用；
[0036](3)使用磁珠法对PCR扩增产物进行纯化，将纯化后的扩增子文库使用Fluorometer Qubit进行浓度测定，记录文库浓度，并将pool
‑
1和pool
‑
2的纯化产物等质量混合，得到文库；然后(使用Agilent 4200 TapeStation或Agilent 2100 Bioanalyzer system)对文库进行片段长度测定，若片段长度主要分布在300
‑
500bp，主峰在380
±
10bp，质检合格，定量混样，上机测序；若长度分布超出300
‑
500bp，或者主峰不在380
±
10bp之间，重复建库并质检若再次不合格，检测中止，空白质控组应为不合格，否则代表有核酸污染，无需测序上机。
[0037]进一步的，步骤(2)中所述的PCR反应体系，具体的如下表3所示：
[0038]表3 PCR反应体系
[0039][0040]进一步的，步骤(2)中所述的PCR扩增程序，具体如下表4所示：
[0041]表4 PCR扩增程序
[0042][0043][0044]进一步的，所述的待检测的核酸来自包含但不限于血液、石蜡包埋组织和冰冻切片组织等。
[0045]进一步的，所述的上机测序为高通量测序，高通量测序的平台包含但不限于
Illumina HiSeq/MiSeq、Life的Ion Torrent/Proton平台、华大基因的BGISEQ
‑
500/50等测序平台。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测心脑血管多种疾病易感基因的多重PCR特异性引物组，其特征在于：该引物组包括207对特异性引物，分成两个Pool，Pool
‑
1包含100对引物，核酸序列如SEQ ID:P 1
‑
200所示；Pool
‑
2包含107对引物，核酸序列如SEQ ID:P 201
‑
414所示。2.根据权利要求1所述的检测心脑血管多种疾病易感基因的多重PCR特异性引物组，其特征在于：所述的多种疾病为10种，具体为高血压、冠心病、脑卒中、静脉栓塞、心肌梗塞、扩张性心肌病、房颤、心源性猝死、心律失常和血脂异常。3.根据权利要求1所述的检测心脑血管多种疾病易感基因的多重PCR特异性引物组，其特征在于：所述的207对特异性引物分别对应的检测位点如下所示：
4.根据权利要求3所述的检测心脑血管多种疾病易感基因的多重PCR特异性引物组，其特征在于：在引物设计时，每对引物之间的退火温度差异小于2摄氏度，扩增产物长度在200
‑
300bp之间。5.一种高通量测序文库构建的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1
‑
4任一权利要求所述的207对特异性引物中的至少一对。6.根据权利要求5所述的高通量测序文库构建的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括207对特异性引物、Index、酶混合物、PCR Enhancer和无核酸酶水。7.根据权利要求5所述的高通量测序文库构建的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包
括质控品和空白质控品，其中的质控品为正常人基因组DNA，空白质控品为无核酸酶水。8.根据权利要求5所述的高通量测序文库构建的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒具体组分如下：9.一种基于多重PCR和高通量测序技术检测基因多态性位点的方法，其特征在于：该方法包括：(1)待检测的核酸提取及质控；(2)用特异性引...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹继华，林有升，王石，丁瑜，邹玄，刘晓光，
申请(专利权)人：宁波美康盛德医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：