用于检测胃癌的试剂盒及其应用制造技术

一种用于检测胃癌的试剂盒及其应用，其特征在于:该试剂盒包括血浆游离DNA甲基化处理试剂、PCR检测预混液、PCR检测核苷酸预混液、质控品试剂，所述PCR检测核苷酸预混液中含有核苷酸序列，具体包括：核苷酸序列01、核苷酸序列02、核苷酸序列03、核苷酸序列04、核苷酸序列05、核苷酸序列06、核苷酸序列07、核苷酸序列08、核苷酸序列09、核苷酸序列10、核苷酸序列11、核苷酸序列12、核苷酸序列13、核苷酸序列14。具有测结果准确度高、使用样本量少、操作简单、检测稳定，一次可以对多个胃癌标记物的甲基化异常进行分析，检测灵敏度高，可实现胃癌的早期发现、实时监控，及胃癌复发的诊断的优点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测胃癌的试剂盒及其应用
本专利技术属于肿瘤学生物检测
，尤其涉及一种用于检测胃癌的试剂盒及其应用。
技术介绍
胃癌是东亚地区的特色癌症，发病率可达32.1/10万人，死亡率则为13.2/10万人，其中日本和韩国的发病率高居世界榜首。根据世界卫生组织的报告，2018年全球有100万例新发胃癌，同时超过78万将会因胃癌而死亡，胃癌是发病率第五高、死亡率第三高的癌症。在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。好发病年龄在50岁以上，男女发病率之比为2：1。饮食结构不合理、生活作息紊乱、工作压力过大以及病原微生物感染(如幽门螺杆菌)等原因，使得胃癌呈现年轻化倾向。胃癌可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部，胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略。我国胃癌病人5年生存率较低，具医学杂志《柳叶刀》)发表的文章《2000-2014年全球癌症生存率变化趋势监测研究报告》数据显示，胃癌5年生存率日本为60.3％，韩国为68.9％，而我国仅35.9％。早期胃癌的5年生存率高达90％以上，晚期胃癌生存率大大降低。而早期胃癌与浅表性胃炎、消化不良等常见消化道疾病症状相似，如腹胀、嗳气、反酸、食欲下降等，出现较为明显的特异症状，如消瘦、出血、黑便时，已经到了中晚期。目前胃癌发生或复发检测的方法及其相关特点包括如下所述：(1)CT检查：可显示出胃癌是否累及胃壁向腔内和腔外生长等，但是临床意义有限。(2)内镜超声：可直接地看到胃壁的各层，了解肿瘤的全貌，有助于胃癌的诊断和TNM分期，但是临床意义有效。(3)内镜诊断：纤维胃镜对胃癌的诊断具有重要意义，可以发现早期胃癌，对良恶性溃疡进行鉴别，确定胃癌的类型和病灶浸润的范围，可对癌前期病变进行随访检查。缺点在于患者依存性差、有一定感染风险。(4)癌胚抗原(CEA)，糖类抗原19-9(CA19-9)，糖类抗原72-4(CA72-4)，胃蛋白酶原等：常规肿瘤标志物，对肿瘤的诊断有辅助作用，对于某项肿瘤标志物升高，连续监测动态变化、联合检测能够提高检查的敏感性，联合其他检查有助于肿瘤的早期诊断。但是检测灵敏度低、特异性差，临床效用有限。大量研究报道，癌细胞在破裂和死亡时，会释放出循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)。ctDNA是一种胞外DNA，主要存在于血液(血清或血浆)、滑膜液和脑脊液等体液中。ctDNA释放入血的机制目前仍无明确结论，现在普遍认为细胞的凋亡和坏死为血液内ctDNA的主要来源。近年来，大量ctDNA检测在肿瘤诊断、治疗中的研究被报道。ctDNA片段化较为严重，使用毛细管电泳检测可以发现主峰在160-180bp左右的弥散带。同时，血液中ctDNA含量较低，研究报道每毫升血液中有5-20ng，虽然也有文献报道更高含量的样本。但是，这样普遍的含量范围给检测造成很大难题，需要有较高灵敏度的检测才有较好的检测效果。部分公司开发的检测为了达到理想的检测效果，使用多至10ml甚至20ml的采血量，而患者对采血量多的检测会有排斥心理，所以使用较少样本量完成检测至关重要。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的上述不足，提供一种测结果准确度高、使用样本量少、操作简单、检测稳定，一次可以对多个胃癌标记物的甲基化异常进行分析，检测灵敏度高，可实现胃癌的早期发现、实时监控，及胃癌复发的诊断的用于检测胃癌的试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种用于检测胃癌的试剂盒，该试剂盒包括血浆游离DNA甲基化处理试剂、PCR检测预混液、PCR检测核苷酸预混液、质控品试剂，所述PCR检测核苷酸预混液中含有核苷酸序列，具体包括：核苷酸序列01、核苷酸序列02、核苷酸序列03、核苷酸序列04、核苷酸序列05、核苷酸序列06、核苷酸序列07、核苷酸序列08、核苷酸序列09、核苷酸序列10、核苷酸序列11、核苷酸序列12、核苷酸序列13、核苷酸序列14。优选的，上述的试剂盒中，核苷酸序列01-14具体的序列为下表所示：表1核苷酸预混液的组成优选的，上述的试剂盒中，所述核苷酸序列04、核苷酸序列11的3’端带有间壁3修饰，或磷酸化修饰。优选的，上述的试剂盒中，所述核苷酸序列04的第5、14、22、32位腺嘌呤核苷酸带有锁核酸修饰。锁核酸修饰可以增加阻遏片段(blocker)对于模板的结合能力，使得阴性模板更易被阻遏。优选的，上述的试剂盒中，所述的游离DNA甲基化处理试剂(溶剂)包括亚硫酸氢盐修饰试剂、DNA保护液、脱磺液(强碱溶液)、结合液、漂洗液、洗脱液(pH＝8.0)、和/或氧化硅磁珠悬浮液。进一步的，所述的亚硫酸氢盐修饰试剂使用时按照40-60g/ml去离子水进行溶解使用。进一步的，所述的DNA保护液可以包含溶解在二甲醚中的水溶性VE，水溶性VE在保护液中的浓度可以为2.5-4.5M(mol/L)，最优浓度为3.4M(水溶性VE在保护液中的浓度)。进一步的，所述的结合液可以包括异硫酸氢胍，异硫酸氢胍在结合液中的浓度为5-8M，最优浓度可以为6.8M。进一步的，所述的脱磺液可以包括氢氧化钠，氢氧化钠在脱磺液中的浓度为1.3-1.8M，最优浓度可以为1.7M。进一步的，所述的漂洗液可以包括75％无水乙醇或者浓度为9-11mM的Tri-Hcl(9-11mM是Tri-Hcl在漂洗液中的浓度)，最优浓度可以为10.6mM。进一步的，所述的洗脱液可以包括Tri-Hcl，Tri-Hcl在洗脱液中的浓度可以为10mmol/L。进一步的，所述的磁珠悬浮液可以为氧化硅磁珠悬浮液，氧化硅磁珠悬浮液可以含有70-90mg/ml氧化硅磁珠，最优浓度可以为82mg/ml(此处浓度是氧化硅磁珠在氧化硅磁珠悬浮液中的浓度)。进一步优选的，上述的试剂盒中，所述质控品包括阳性质控品、阴性质控品、和/或空白质控品。进一步优选的，上述的试剂盒中，所述质控品中阳性质控品(PC)为转甲基后的细胞系gDNA和模拟血浆，阴性质控品(NC)为脱甲基后的人血细胞gDNA和模拟血浆，空白质控品(NTC)为模拟血浆。优选的，上述的试剂盒中，还包括PCR检测预混液，包括聚合酶buffer、DNA热激聚合酶、镁离子、dNTPs、和/或甜菜碱、和/或二甲基亚砜。进一步的，上述的试剂盒中，PCR检测预混液中的聚合酶缓冲液为含有2×聚合酶缓冲液；Taq聚合酶的含量可以为0.26U/μl；二价阳离子可以为MgCl2，其浓度为25mM；dNTPs浓度可以为3.8mM。本专利技术还提供一种上述用于检测胃癌的试剂盒在制备治疗胃癌诊断、胃癌实时监测和术后复发诊断药物中的应用。优选的，多重PCR检测的组合方式包括：ACTB(β-Actin)、RN180；和/或两重PCR检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括血浆游离DNA甲基化处理试剂、PCR检测预混液、PCR检测核苷酸预混液、质控品试剂，所述PCR检测核苷酸预混液中含有核苷酸序列，具体包括：核苷酸序列01、核苷酸序列02、核苷酸序列03、核苷酸序列04、核苷酸序列05、核苷酸序列06、核苷酸序列07、核苷酸序列08、核苷酸序列09、核苷酸序列10、核苷酸序列11、核苷酸序列12、核苷酸序列13、核苷酸序列14。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括血浆游离DNA甲基化处理试剂、PCR检测预混液、PCR检测核苷酸预混液、质控品试剂，所述PCR检测核苷酸预混液中含有核苷酸序列，具体包括：核苷酸序列01、核苷酸序列02、核苷酸序列03、核苷酸序列04、核苷酸序列05、核苷酸序列06、核苷酸序列07、核苷酸序列08、核苷酸序列09、核苷酸序列10、核苷酸序列11、核苷酸序列12、核苷酸序列13、核苷酸序列14。


2.根据权利要求1所述的用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于：所述的核苷酸序列01-14的具体序列为：





3.根据权利要求2所述的用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于：所述的核苷酸序列04、核苷酸序列11的3’端带有间壁3修饰，或磷酸化修饰。


4.根据权利要求2所述的用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于：所述核苷酸序列04的第5、14、22、32位腺嘌呤核苷酸带有锁核酸修饰。


5.根据权利要求2所述的用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于：所述游离DNA甲基化处理试剂包括亚硫酸氢盐修饰试剂、DNA保护液、脱磺液、结合液、漂洗液、洗脱液(pH＝8.0)、和/或氧化硅磁珠悬浮液。


6.根据权利要求5所述的用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于：所述的亚硫酸氢盐修饰试剂使用时按照40-60g/ml去离子水进行溶解使用。


7.根据权利要求5所述的用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于：所述的DNA保护液包含溶解在二甲醚中的水溶性VE，水溶性VE在保护液中的浓度为2.5-4.5M(mol/L)，最优浓度为3.4M。


8.根据权利要求5所述的用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于：所述的结合液包括异硫酸氢胍，异硫酸氢胍在结合液中的浓度为5-8M，最优浓度为6.8M。


9.根据权利要求5所述的用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于：所述的脱磺液包括氢氧化钠，氢氧化钠在脱磺液中的浓度为1.3-1.8M，最优浓度为1.7M。


10.根据权利要求5所述的用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于：所述的漂洗液可以...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹继华，林有升，李再忠，金雪卿，
申请(专利权)人：宁波美康盛德医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33