一种高效纤维素酶诱导物及其制备和应用方法技术

本发明专利技术公开了一种高效纤维素酶诱导物及其制备和应用方法，涉及生物工程与生物技术领域。该高效纤维素酶诱导物为二糖和多聚寡糖的混合物ACM，其中二糖包括槐糖、和\或龙胆二糖、和\或纤维二糖。以葡萄糖或含有所述葡萄糖的糖浆为底物，通过酸催化所述葡萄糖的化学反应，制备该高效纤维素酶诱导物；该高效纤维素酶诱导物应用于高效生产纤维素酶。本发明专利技术中ACM的制备仅需要硫酸作为催化剂，制备时间短，过程简单，大大降低了生产设备投资，降低了纤维素酶生产的成本。而且高酶活的纤维素酶可以直接用于木质纤维素类生物质炼制过程中纤维素组分的水解。从而进一步降低木质纤维素利用成本。成本。成本。

A high efficiency cellulase inducer and its preparation and application method

【技术实现步骤摘要】
一种高效纤维素酶诱导物及其制备和应用方法


[0001]本专利技术涉及生物工程与生物
，尤其涉及一种高效纤维素酶诱导物及其制备和应用方法。

技术介绍

[0002]传统化石能源的开发与利用为现代社会和工业的快速发展提供了可能。然而，在社会的快速发展下，由化石能源所带来的资源短缺与环境污染问题日益严重。因此，为解决环境污染和资源短缺的问题，人类必须开发新的可持续能源。生物能源是被认为可以替代化石能源的新型能源。生物能源可再生且对环境友好，同时在生物能源生产过程中也可以实现碳中和的宏大目标。因此以玉米秸秆等木质纤维素类等可再生原料生产生物能源具有巨大潜力。玉米秸秆价格便宜且产量巨大，如果可以开发出利用玉米秸秆作为原料生产以生物乙醇等的能源类物质，将能在很大程度上缓解甚至解决由化石资源所带来的几大问题。
[0003]然而非常遗憾的是，目前为止，利用木质纤维素等作为原料生产生物能源或者其他生物基品的技术还远没有被工业化，其中的主要原因是由木质纤维素类原料变成可发酵性糖要经过许多步骤。首先，结构致密的木质纤维素类原料首先需要通过预处理使其结构松散，然后预处理后的物料要通过纤维素酶将其酶解成可发酵性糖，最后再用可发酵性糖生产生物燃料或者其他生物基品。众多步骤导致了木质纤维素乙醇的生产成本难以到达工业化要求。在总成本中，酶水解步骤约占30％，因此酶水解过程的高成本一直是木质纤维素的工业化利用的瓶颈。因此只有开发高效的纤维素酶制剂才能降低酶解过程的成本，从而使得纤维素乙醇的生产成为可能。
[0004]目前，利用微生物发酵的方法生产纤维素酶已经有很长的历史，其中里氏木霉(Trichoderma reesei)，草酸青霉(Penicillium oxalicum)粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)等是目前为止已被证明可以生产纤维素酶的微生物，其中里氏木霉生产纤维素酶的产量高、酶系全，因此被研究的最为广泛。但遗憾的是，目前里氏木霉的产酶效率还不足以降低酶水解步骤的成本，因此还需要提高里氏木霉生产纤维素酶效率。在提高里氏木霉生产纤维素酶的效率过程中遇到了许多瓶颈，其中最为重要的问题是里氏木霉生产纤维素酶需要诱导物，里氏木霉只有在诱导物的诱导作用下才能分泌纤维素酶。诱导效果低且昂贵的诱导物的额外添加是纤维素酶生产成本高的最重要原因。因此为解决上述问题，本文的研究核心是开发出价格低廉且高效的纤维素酶诱导物，降低纤维素酶生产成本，从而进一步降低木质纤维素利用成本，为木质纤维素工业化利用提供了可能。
[0005]目前工业上主要采用乳清作为里氏木霉的产纤维素酶的诱导物，但乳糖价格昂贵且对里氏木霉诱导效果不佳，其他研究中的诱导物研究主要集中在微晶纤维素，处理后的木质纤维素原料等，但微晶纤维素价格更为昂贵，而木质纤维素物料诱导效果极差，因此这些原料都不能满足工业上的要求。近年来，大量的工作表明由β
‑
糖苷键连接而成的寡糖类物质如(纤维二糖、龙胆二糖、槐糖等)可以高效诱导里氏木霉生产纤维素酶。但是由于分离
纯化等因素成本高，使其价格十分昂贵。因此，如果可以实现上述寡糖类物质的低成本的高效生产，就可以实现纤维素酶的高效生产。从而降低纤维素酶生产成本并进一步降低木质纤维素利用成本。
[0006]因此，本领域的技术人员致力于开发一种低成本的高效生产的高效纤维素酶诱导物及其制备和应用方法。

技术实现思路

[0007]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何提供一种低成本高效生产高效的纤维素酶诱导物以及其制备方法和应用方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了一种高效纤维素酶诱导物，该诱导物为二糖和多聚寡糖的混合物ACM(Acid
‑
catalyzed mixture)，其中二糖包括槐糖、和\或龙胆二糖、和\或纤维二糖。
[0009]本专利技术还提供了一种高效纤维素酶诱导物的制备方法，以葡萄糖或含有葡萄糖的糖浆为底物，通过酸催化葡萄糖的化学反应，制备高效纤维素酶诱导物；过程中通过ACM流加补料策略，控制发酵反应中还原糖的浓度在1g/L以下。
[0010]进一步地，上述酸包括能够提供H+进行催化的化学试剂。
[0011]进一步地，能够提供H+进行催化的化学试剂包括液体酸或固体酸，液体酸包含硫酸、磷酸或盐酸等，固体酸包括amberlyst15或amberlyst35等。
[0012]进一步地，所采用的酸为硫酸，且酸的浓度不低于40mM。
[0013]进一步地，底物中葡萄糖的浓度大于或者等于300g/L。
[0014]进一步地，底物中葡萄糖浓度不低于700g/L。
[0015]进一步地，液体酸的浓度大于1mM，固体酸的浓度大于0.01％(重量/重量)。
[0016]进一步地，催化的方法为将酸加入底物中，然后孵育，孵育的温度为50
‑
250℃，孵育的时间为1min
–
100h，其中加入的酸的浓度越高，孵育的温度越低，孵育的时间越短。
[0017]进一步地，所采用的温度不低于120℃，加热时间不低于1h。
[0018]进一步地，配制好700g/L的葡萄糖溶液后，加20mL葡萄糖溶液到50mL的防爆瓶中，加浓硫酸127.6μL使得硫酸浓度为120mM，并于140℃油浴锅中加热1h。
[0019]本专利技术还提供一种高效纤维素酶诱导物在高效生产纤维素酶的应用。
[0020]进一步地，应用方法包括以下步骤：以ACM为碳源和诱导物，培养可以生产纤维素酶及其组分的微生物高效生产纤维素酶，微生物包括自然界或通过人工诱变和基因改造的。
[0021]进一步地，可以生产纤维素酶及其组分的微生物包括里氏木霉(Trichoderma reesei)或草酸青霉(Penicillium oxalicum)，将里氏木霉(Trichoderma reesei)或草酸青霉(Penicillium oxalicum)的孢子接种于固体培养基(PDA)中，温度为28℃条件下培养7天，用无菌水洗，得到孢子液体；将孢子液体接种于液体培养基中，在温度为28℃，转速为150rpm条件下摇床培养24h，即得到菌丝液体；用ACM作为产酶培养基的唯一碳源，诱导菌丝液体生产纤维素酶。
[0022]进一步地，以ACM作为碳源和诱导物培养T.reesei时，发酵罐内的葡萄糖浓度小于1g/L。
[0023]进一步地，纤维素酶生产菌株来自T.reesei，美国典型培养物保藏中心编号为ATCC56765及中国工业微生物保藏中心编号为CICC13052的T.reesei RUT C30。
[0024]本专利技术，技术人员可以根据T.reesei培养的常识，对发酵培养基的组成进行调整。
[0025]在本专利技术的较佳实施方式1中，详细说明使用硫酸催化葡萄糖反应制备ACM；
[0026]在本专利技术的另一较佳实施方式2中，详细说明使用固体酸amberlyst15催化葡萄糖反应制备ACM；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效纤维素酶诱导物，其特征在于，所述诱导物为二糖和多聚寡糖的混合物ACM(Acid
‑
catalyzed mixture)，所述二糖包括槐糖、和\或龙胆二糖、和\或纤维二糖。2.如权利要求1所述的一种高效纤维素酶诱导物的制备方法，其特征在于，所述方法是以葡萄糖或含有所述葡萄糖的糖浆为底物，通过酸催化所述葡萄糖的化学反应，制备所述高效纤维素酶诱导物；通过所述ACM批式补料流加策略诱导产酶，控制所述产酶反应中还原糖的浓度在1g/L以下。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酸包括能够提供H+进行催化的化学试剂。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述能够提供H+进行催化的化学试剂包括液体酸或固体酸，所述液体酸包含硫酸、磷酸或盐酸，所述固体酸包括amberlyst15或amberlyst35。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述底物中所述葡萄糖的浓度大于或者等于300g/L。6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，加入的所述液体酸的浓度大于1mM，所述固体酸的浓度大于0.01％(重量/重量)。7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述方法中，所述催化的方法为将所述酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晨光，邓林，白凤武，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：