一种人工蛋白骨架及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种人工蛋白骨架及其应用。本发明专利技术首先提供一种人工蛋白骨架肽段分子，其包括来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽。本发明专利技术具体提供了SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成的肽段分子及其编码核酸分子。本发明专利技术的肽段分子或核酸分子可应用于微生物体内的人工蛋白骨架技术，用于细胞膜酶之间的组装，或应用于细胞质酶和细胞膜酶之间的组装，能提高合成效率；或利用其识别特性，实现酶的特异识别、连接及共定位。连接及共定位。

【技术实现步骤摘要】
一种人工蛋白骨架及其应用


[0001]本专利技术是关于人工蛋白骨架技术，具体地说，是关于一种可应用于微生物体内的人工蛋白骨架、其制备方法及相关应用。

技术介绍

[0002]人工构建微生物合成体系时，针对一种目标产物的合成大多有多步催化反应。天然的生物催化体系通常在细胞内形成物理上、空间上组织有序的多酶复合体、酶分子脚手架或者反应微区，这种高效的组织性带来了高效的催化能力。然而人工构建的微生物合成体系多不存在这种高效的组织性，即参与合成的催化酶在细胞内的分布多有差异，最直接的影响即为中间代谢产物的传质效率较低，由此引发目标途径合成效率低、代谢流不平衡、影响细胞生长等问题，很大程度上限制了微生物合成体系的生物制造潜力(Dahl R,Zhang F,Alonso
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Gutierrez J,Baidoo E,Batth T,Redding
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Johanson A,Petzold C,Mukhopadhyay A,Lee T,Adams P.Engineering dynamic pathway regulation using stress
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response promoters.Nat Biotechnol,2013,31(11):1039
‑
1046)。如果能够开发空间上高度有序组织酶分子的技术，即人工蛋白骨架技术，防止中间体扩散，提高中间代谢产物的传输效率，降低中间代谢产物的去往竞争途径流向的损失，减少不稳定中间体降解的损失，减少中间体通过时间，规避不利平衡，将很大程度上改善微生物合成体系合成效率低的问题。
[0003]人工蛋白骨架技术具有简便易操作性及高效性，通过简单的多肽相互作用域与其特定配体之间的工程化，即可增加总体途径通量，同时减少代谢负荷，基于此特点，目前研究人员已开发了一些用于酶组装的人工蛋白骨架技术。例如，动物细胞信号传导的配体能够和受体特异性识别，利用此特性，Dubber等人在大肠杆菌体内开发了可用于蛋白组装的支架，命名为GBD
x
SH3
y
PDZ
z
，通过配体和受体之间的蛋白
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肽相互作用将乙酰辅酶A合成到甲羟戊酸途径的三个酶进行组装，实现了目标产物产量的显著改善(Dueber J,Wu G,Malmirchegini G,Moon T,Petzold C,Ullal A,Prather K,Keasling J.Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux.Nat Biotechnol,2009,27(8):753
‑
759)。
[0004]然而，现有蛋白骨架技术组装酶的种类十分有限，主要应用于较短的代谢通路中，如大多为两种酶的组装，少有三种以上酶的组装，且已开发的蛋白骨架技术非常少，应用场景没有明确的说法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的在于提供一种人工蛋白骨架新技术。
[0006]本专利技术针对现有技术的不足，开发了一种应用于微生物体内的人工蛋白骨架技术(DEBS
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EAL，脱氧红霉内酯合成酶
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酶组装流水线)(图1)，其基于红霉素聚酮合酶结构，将其结构模块间可互相特异识别的非共价连接肽，作为该技术的核心，这些可互相特异识别的
连接肽可分别装配表达在拟组装的催化酶上，并分别应用于虾青素代谢途径种的胞质酶和膜酶上。
[0007]具体而言，一方面，本专利技术提供了一种人工蛋白骨架肽段分子，其包括来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽。
[0008]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的人工蛋白骨架肽段分子，其中，所述I型非迭代聚酮合酶包括红霉素聚酮合酶、雷帕霉素聚酮合酶、他克莫司聚酮合酶、金链菌素聚酮合酶、阿维菌素聚酮合酶、多杀菌素聚酮合酶、埃博霉素聚酮合酶、盐霉素聚酮合酶中的一种或多种。优选地，所述肽段分子可以来源于I型非迭代聚酮合酶的模块间的可互相识别的特异识别肽。
[0009]根据本专利技术的一些具体实施方案，本专利技术开发了一种DEBS
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EAL人工蛋白骨架序列，其中：
[0010]基于I型非迭代聚酮合酶
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红霉素聚酮合酶的基因序列，其非共价连接基因序列有两对，分别位于模块2的C端(M2
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C)、模块3的N端(M3
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N)，以及模块4的C端(M4
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C)、模块5的N端(M5
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N)，且两两分别特异识别连接。雷帕霉素聚酮合酶非共价连接序列有2对，分别为RapA
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C、RapB
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N以及RapB
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C、RapC
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N。他克莫司聚酮合酶非共价连接序列有2对，分别为FkbB
‑
C、FkbC
‑
N以及FkbC
‑
C、FkbA
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N。这些连接酶肽段分子具有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
[0011]另一方面，本专利技术还提供一种编码人工蛋白骨架肽段分子(连接酶肽段)的核酸分子，其编码上述的连接酶肽段分子。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。
[0012]另一方面，本专利技术还提供了所述的人工蛋白骨架肽段分子或所述的核酸分子在制备人工蛋白骨架中的应用，其中是将来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽作为人工蛋白骨架对目标蛋白进行组装。优选地，所述目标蛋白为非聚酮合酶。
[0013]另一方面，本专利技术还提供了一种构建体，其含有本专利技术所述的核酸分子。
[0014]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中所述构建体还含有目标代谢途径基因核酸分子。
[0015]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中所述构建体可以为质粒、宿主细胞或微生物。
[0016]另一方面，本专利技术还提供了一种应用人工蛋白骨架进行生物体代谢产物合成的方法，其包括：
[0017]将来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽引入目标产物代谢途径酶，构建含有人工蛋白骨架的微生物突变株；
[0018]进行微生物突变株的发酵培养，得到目标代谢产物。
[0019]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的应用人工蛋白骨架进行生物体代谢产物合成的方法中，所述微生物可以为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌中任一种或多种。
[0020]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的应用人工蛋白骨架进行生物体代谢产物合成的方法中，所述的代谢产物可以为萜类化合物、维生素、聚酮化合物、非核糖体肽或核糖体肽中任一种或多种，不局限于虾青素。
[0021]根据本专利技术的具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工蛋白骨架肽段分子，其包括来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽。2.根据权利要求1所述的人工蛋白骨架肽段分子，其中，所述I型非迭代聚酮合酶包括红霉素聚酮合酶、雷帕霉素聚酮合酶、他克莫司聚酮合酶、金链菌素聚酮合酶、阿维菌素聚酮合酶、多杀菌素聚酮合酶、埃博霉素聚酮合酶、盐霉素聚酮合酶中的一种或多种；优选地，所述肽段分子来源于I型非迭代聚酮合酶的模块间的可互相识别的特异识别肽；更优选地，所述肽段分子包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成的多肽中的一种或多种。3.一种核酸分子，其编码如权利要求1或2所述的人工蛋白骨架肽段分子。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其具有SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。5.权利要求1或2所述的人工蛋白骨架肽段分子或权利要求3或4所述的核酸分子在制备人工蛋白骨架中的应用，其中是将来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽作为人工蛋白骨架对目标蛋白进行组装；优选地，所述目标蛋白为非聚酮合酶。6.一种构建体，其含有权利要求3或4所述的核酸分子；优选地，所述构建体还含有目标...

【专利技术属性】
技术研发人员：马田，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：