一种左乙拉西坦衍生物、免疫原、抗左乙拉西坦特异性抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种左乙拉西坦衍生物、免疫原、抗左乙拉西坦特异性抗体及其制备方法与应用。首先将新型左乙拉西坦衍生物与经过基因工程改造得到的重组鸭卵清白蛋白偶联制得左乙拉西坦人工抗原，再用左乙拉西坦人工抗原免疫实验动物获得抗左乙拉西坦特异性抗体，经ELISA检测表明该特异性抗体的特异性强、灵敏度高，干扰实验显示该特异性抗体与100种常见药物无任何交叉反应；将抗左乙拉西坦特异性抗体应用于制备左乙拉西坦检测试剂，包括左乙拉西坦均相酶免疫检测试剂与左乙拉西坦胶乳增强免疫比浊检测试剂，所述检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对左乙拉西坦的高通量、快速化检测。速化检测。速化检测。

【技术实现步骤摘要】
一种左乙拉西坦衍生物、免疫原、抗左乙拉西坦特异性抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种左乙拉西坦衍生物、免疫原、抗左乙拉西坦特异性抗体及其制备方法与应用，属于生物医学检测


技术介绍

[0002]左乙拉西坦（leve
‑
tiracetam，LEV）是一种新型抗癫痫药物（AED），左乙拉西坦的化学名称为(S)
‑
α
‑
乙基
‑2‑
氧代
‑1‑
吡咯烷乙酰胺，由S
‑2‑
氨基丁酰胺盐酸盐和4
‑
氯丁酰氯为起始原料，经环合反应得环合物（左乙拉西坦粗品），对粗品精制得到终产品左乙拉西坦，其分子式为：C8H14N2O2，相对分子量为：170.21。主要通过选择性抑制癫痫样突发放电超同步性和癫痫发作的传播而发挥疗效，属于吡咯烷酮衍生物。我国国家食品药品监督管理局批准的适应症为：用于成人及4岁以上儿童癫痫患者部分性发作的添加治疗。本品具有生物利用度高、药动学呈线性、蛋白结合率低、肝脏代谢少、能快速获得稳定血药浓度和药物相互作用小等特点，是临床用药较安全的药物。
[0003]左乙拉西坦剂量与血药浓度相关性良好，超过12h采血，左乙拉西坦剂量与血药浓度相关性差。由于肾功能不全对左乙拉西坦的清除率有关，因此应针对肾功能不全患者调整左乙拉西坦的用药剂量。无论是左乙拉西坦单独使用，还是与其他药物联合使用，其血药浓度不受联合用药影响；左乙拉西坦药物不良反应多发生于用药初期，如：嗜睡、睡眠不佳、烦躁、易怒、食欲不佳、恶心呕吐、腹痛、腹泻等。耐受后多数症状可自行缓解，无严重药物不良反应发生。左乙拉西坦在儿童体内消除速率快，半衰期短，用药依从性差，且癫痫患儿需长期服药，因此在儿科临床用药时，通过对左乙拉西坦的血药浓度进行监测，可为患儿提高疗效、服药依从性和观察特殊状态药代动力学（肾功能异常、老人、孩子、孕妇等）提供依据。因此左乙拉西坦的血药浓度与服药剂量和种类及患者的个体差异都有很大关系，需要在治疗过程中进行血药浓度监测以便更好的控制癫痫。
[0004]左乙拉西坦的血药浓度检测方法有多种，包括液相色谱
‑
串联质谱法(LC
‑
MS/MS)、高效液相色谱法（HPLC）等。液相色谱
‑
串联质谱法可大大简化样品纯化过程，且结果不受左乙拉西坦代谢产物的干扰，线性范围广、定量下限低，但对试验的要求较高，其前处理较为复杂，条件不易控制。高效液相色谱法具有准确、灵敏、廉价的特点，但测定时间较长，测定结果中常常包含代谢物浓度，且该方法检测浓度有限，操作繁琐、重现性较差，难以实现自动化监测，制约了其在临床检测上的大规模使用。
[0005]因此，目前市面上缺乏线性范围宽、灵敏度高、准确度高、精密度高，检测时间短，样品处理简单，仪器自动化程度高，可多样本连续检测的左乙拉西坦检测产品。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种左乙拉西坦衍生物，该衍生物为新合成的化合物，自然界中不存在。
[0007]本专利技术的第一个目的采用以下技术方案实现：一种左乙拉西坦衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ。
[0008]本专利技术的第二个目的在于提供一种如上所述的左乙拉西坦衍生物的合成方法，该合成方法不同于常规合成方法，具有良好的合成效果，显著提高了左乙拉西坦衍生物的合成效率。
[0009]本专利技术的第二个目的采用以下技术方案实现：一种如上述结构式Ⅰ所示的左乙拉西坦衍生物的合成方法，反应过程如下式所示：；具体的，反应过程包括以下步骤：（A1）化合物2的合成：将化合物1 (22 g，129.4 mmol)与NaH (6.28 g，155.3 mmol)共同溶解于DMF (1 L)中，然后在室温下加入5
‑
溴戊酸苄酯(53 g，194 mmol)制成反应混合物。将此反应混合液搅拌18 小时，然后加入2 L纯化水终止反应。将反应结束后的溶液用DCM (1 L)进行萃取，
重复3次，将萃取得到的有机层用Na2SO4进行干燥，并在真空中浓缩。将所得残留物通过快速色谱层析柱(乙酸乙酯:己烷0
‑
50%)进行纯化，得到化合物2。
[0010]（A2）左乙拉西坦衍生物的合成：将化合物2 (3.0 g，8.3 mmol)与钯碳催化剂(500 mg)共同溶解于THF (50 mL)中制成反应混合物，将此反应混合物在H2条件下搅拌3小时。将反应结束后的反应混合物进行过滤，然后在真空中进行浓缩。将所得残留物通过快速色谱层析柱(甲醇:二氯甲烷0
‑
10%)进行纯化，得到左乙拉西坦衍生物。
[0011]本专利技术的第三个目的在于提供一种左乙拉西坦免疫原。
[0012]本专利技术的第三个目的采用以下技术方案实现：一种左乙拉西坦免疫原，所述左乙拉西坦免疫原由上述结构式Ⅰ所示的左乙拉西坦衍生物与载体蛋白连接而成，其结构式如式Ⅱ所示：式Ⅱ；其中，载体蛋白为重组鸭卵清白蛋白，进一步地，所述重组鸭卵清白蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
[0013]重组鸭卵清白蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：1）具体如下：MGSIGAASTEFCFDVFRELRVQHVNENIKYSPFSIISALAMVYLGARDNTRTQIDKKVHFDKLPGFGESMEAQCGTSVSVHKSLRDILTQITKPSDNFSLSFASRLYAEKTYAILPEYLQCVKELYKGGLESISFQTAKDQARELINSWVESQTNGIIKNILQPSKVDSQTTMVLVNAIYFKGMWEKAFKDEDTQAMPFRMTEQKSKPVQMMYQVGSFKVAMVTSEKMKILELPFASGKMSMFVLLPDEVSGLEQLESTISFEKLTEWTSKTMMEERRMKVYLPRMKMEKKYNLTSVFMALGMTDLFSSSANMSGISKTVSLKMSEAVHAACVEIFEAGRDVKGSAEAGMDVTSVSEKFRADHPFLFFIKHNPTNSILFFGRWMSP本专利技术的第四个目的在于提供一种如上所述的左乙拉西坦免疫原的制备方法。
[0014]本专利技术的第四个目的采用以下技术方案实现：一种如上所述的左乙拉西坦免疫原的制备方法，包括以下步骤：（B1）载体蛋白溶液的制备：将上述的重组鸭卵清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液；（B2）左乙拉西坦衍生物溶液的制备：将上述结构式Ⅰ所示的左乙拉西坦衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1
‑
乙基
‑3‑
(
‑3‑
二甲氨丙基)碳二亚胺和N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到左乙拉西坦衍生物溶液；
（B3）左乙拉西坦免疫原的合成：将步骤（B2）得到的左乙拉西坦衍生物溶液加入到步骤（B1）得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种左乙拉西坦衍生物，其特征在于，其结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ。2.一种如权利要求1所述的左乙拉西坦衍生物的合成方法，其特征在于，所述合成方法如下式所示：。3.一种左乙拉西坦免疫原，其特征在于，所述左乙拉西坦免疫原由权利要求1所述的左乙拉西坦衍生物与载体蛋白连接而成，其结构式如式Ⅱ所示：式Ⅱ；其中，载体蛋白为重组鸭卵清白蛋白。4. 根据权利要求3所述的左乙拉西坦免疫原，其特征在于，所述重组鸭卵清白蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。5.一种如权利要求3
‑
4任一项所述的左乙拉西坦免疫原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：（B1）载体蛋白溶液的制备：将权利要求3
‑
4任一项中所述的重组鸭卵清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液；（B2）左乙拉西坦衍生物溶液的制备：将权利要求1所述的左乙拉西坦衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1
‑
乙基
‑3‑
(
‑3‑
二甲氨丙基)碳二亚胺和N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到左乙拉西坦衍生物溶液；
（B3）左乙拉西坦免疫原的合成：将步骤（B2）得到的左乙拉西坦衍生物溶液加入到步骤（B1）得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到左乙拉西坦免疫原。6.一种抗左乙拉西坦特异性抗体，其特征在于，所述抗左乙拉西坦特异性抗体为使用权利要求3
‑
4任一项所述的左乙拉西坦免疫原对实验动物进行注射后所得到的特异性抗体，所述的实验动物为兔子、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠或马中的一种。7.一种如权利要求6所述的抗左乙拉西坦特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含以下步骤：（C1）将权利要求3
‑
4任一项所述的左乙拉西坦免疫原用磷酸盐缓冲液稀释，得到左乙拉西坦人工抗原溶液，然后将左乙拉西坦人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对权利要求6中所述的实验动物进行多点注射；（C2）3
‑
6周后，再用相同的左乙拉西坦人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物进行多点注射，之后每隔3
‑
6周注射一次，共计注射3
‑
10次；（C3）对步骤（C2）中完成注射的实验动物取血，分离纯化，得到抗左乙拉西坦特异性抗体。8.如权利要求6
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小可，王惠敏，郑磊，韦志，
申请(专利权)人：长沙博源医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：