一种白颌大树蛙防御肽Zs-CATH及其基因和应用制造技术

本发明专利技术属于多肽应用技术领域，具体提供了白颌大树蛙防御肽Zs

【技术实现步骤摘要】
一种白颌大树蛙防御肽Zs
‑
CATH及其基因和应用


[0001]本专利技术属于多肽应用
，具体涉及一种白颌大树蛙防御肽Zs
‑
CATH及其基因和应用。

技术介绍

[0002]近年来的研究表明，抗菌肽是所有动物、植物和微生物防御系统中的一个重要组成部分。它们是机体为抵御病原微生物侵袭而产生的一类小分子活性多肽，具有分子量小、稳定性好、杀菌迅速和不易产生耐药性等特点。这些特性使得抗菌肽具有非常广阔的运用前景，有望替代目前临床上易于产生耐药性的传统抗生素药物。抗菌肽不易产生耐药性的原因是，其杀菌机理与传统抗生素不同。它们主要是作用于细菌的细胞膜,破坏其稳定性，进而细胞膜渗透性发生改变，使得内容物外泄导致细胞死亡。不同物种来源或同一物种中抗菌肽的结构形式和生物活性差别较大。国内外研究人员一直致力于从不同物种中发掘结构新颖的抗菌肽，直接利用或者以其为模板进行分子改造。目前，已有抗菌肽用于海产品保鲜和动物饲料添加剂中。结合生态环境从各种自然资源中发掘具有潜在药用价值的抗菌肽是目前多肽新药研究的一个热点。
[0003]两栖动物是抗菌肽资源发掘中最重要的一类资源，其皮肤裸露，为抵御环境中各种微生物的侵袭，它们能够分泌多种分子结构新颖、功能复杂多样的的抗菌肽。这些活性多肽广泛参与机体的各种生理活动，具有各种药理活性，如抗微生物、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、创伤修复、镇痛等作用。树蛙与其它的两栖动物明显不同的地方就是，它们的大部分时间都是在树上度过，而其它的两栖动物大部分时间都在水里或陆地上。这种特异的树栖生活使得它们面临的天敌以及外界微生物都与其他的两栖动物有所差异，经过适应性进化，必然拥有一套具有自身优势的先天免疫防御系统。
[0004]据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，而且有些已进入临床阶段。虽然我国对两栖动物应用有着悠久的历史，但是都是整体入药，对其活性成分和药理性质的研究比较薄弱。白颌大树蛙主要分布于云南、西藏等地，是我国特色资源动物之一，但其皮肤分泌物中cathelicidin家族的抗菌肽少有报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术中树蛙分泌的多肽研究薄弱的问题。
[0006]为此，本专利技术提供了一种白颌大树蛙防御肽Zs
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CATH，该防御肽Zs
‑
CATH是中国两栖类白颌大树蛙防御肽基因编码的一种环状多肽，分子量3602.47道尔顿，等电点10.49，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1(ASKKGKCNFMCKVKQKLRAIGSKTVIGTVVHKI)所示。
[0007]SEQ ID NO.1：
[0008][0009]其第七位半胱氨酸和第十一位半胱氨酸组成一对分子内二硫键。
[0010]该白颌大树蛙防御肽前体的编码基因由628个核苷酸(SEQ ID NO:2)组成，其自5
’
端至3
’
端序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]SEQ ID NO.2：
[0012][0013][0014]其中，第352
–
450位核苷酸为成熟白颌大树蛙防御肽Zs
‑
CATH的编码基因。
[0015]本专利技术提供的这种白颌大树蛙防御肽Zs
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CATH可用于制备广谱抗微生物(包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌)试剂，还对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粪产碱菌引起的感染疾病具有显著的治疗的作用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：
[0017]本专利技术提供的这种新的具有广谱抗微生物性白颌大树蛙防御肽Zs
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CATH对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粪产碱菌引起的感染疾病具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可作抗菌剂和医疗器械涂布药物。
[0018]以下将结合附图对本专利技术做进一步详细说明。
附图说明
[0019]图1是本专利技术提供的白颌大树蛙防御肽Zs
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CATH在不同浓度SDS溶液中的圆二色(CD)光谱分析示意图。
[0020]图2是本专利技术提供的白颌大树蛙防御肽Zs
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CATH在不同浓度LPS溶液中的圆二色(CD)光谱分析示意图。
具体实施方式
[0021]下面将结合实施例对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本专利技术的代表性实施例，但是本专利技术所属
的普通技术人员将理解，在不脱离本专利技术范围的情况下可以对本专利技术进行各种修改和改变。因此，本专利技术的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
[0022]实施例1：白颌大树蛙防御肽Zs
‑
CATH的制备和氨基酸序列测定
[0023]1、白颌大树蛙皮肤总RNA提取：
[0024]活体白颌大树蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻10小时，取300mg皮肤组织，加入3ml的Trizol溶液，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。上清中加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为白颌大树蛙皮肤总RNA。
[0025]2、白颌大树蛙皮肤mRNA的纯化：
[0026]mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems试剂盒。
[0027]提取的白颌大树蛙皮肤总RNA溶于500μl的DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加入3μl的Oligo(dT)探针和13μl的20
×
SSC溶液，混匀后放置室温冷却，称为A液。将磁珠(SA
‑
PMP)轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.3m1的0.5
×
SSC，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5
×
SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1
×
SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1 DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的白颌大树蛙皮肤mRNA。加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于
‑
70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl＝的DEPC水中。
[0028]3、白颌大树蛙皮肤cDNA文库构建：
[0029]采用CLONTECH公司Creator
TM SMART TM cDNA Library ConstructionKit质粒cDNA文库构建试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白颌大树蛙防御肽Zs
‑
CATH，其特征在于：该防御肽Zs
‑
CATH是中国两栖类白颌大树蛙防御肽基因编码的一种环状多肽，分子量3602.47道尔顿，等电点10.49，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码白颌大树蛙防御肽Zs
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CATH前体的基因，其特征在于：所述基因GenBankAccessionNumber:OM365993由628个核苷酸组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈艳，武静，杨海龙，木丽仙，米鍇，边慧，刘彤，吕靖，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：