一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法技术

本发明专利技术一种产顺

【技术实现步骤摘要】
一种产顺
‑
11
‑
十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法


[0001]本专利技术涉及一种产顺
‑
11
‑
十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，特别涉及一种破囊壶菌进行氮离子诱变进行选育，从而获得高产菌株的方法。
技术背景
[0002]小菜蛾作为农业生产中最为常见的害虫之一，广泛分布在中国多个粮食产区。近年来，有许多学者鉴定出顺
‑
11
‑
十六碳烯醛是小菜蛾信息素的主要有效成分，利用小菜蛾信息素可以高效、精准的诱捕并杀死害虫，达到绿色防治的目的。然而，目前市场上多数使用化学合成法生产顺
‑
11
‑
十六碳烯醛，造成了不必要的环境污染和资源浪费。因此，筛选并培育高产顺
‑
11
‑
十六碳烯醛的破囊壶菌迫在眉睫。
[0003]在微生物菌种选育过程中，氮离子诱变是主要方法之一。利用简单高效的氮离子诱变技术，可以使菌株在非自然条件下大幅提高突变效率，进而挑选出所需的高产菌。提高破囊壶菌的顺
‑
11
‑
十六碳烯醛产量可以大幅提高发酵效率，带来巨大的经济效益。
[0004]关于培育破囊壶菌产脂肪酸的方法有很多，如专利(CN201811209492.X)采用紫外光诱变破囊壶菌使其高产二十二碳六烯酸，虽然操作简单、成本低，但是有利变异少，诱变的方向和性质不能控制；或如专利(CN201911192842.0)通过改良破囊壶菌液体MP培养基及破囊壶菌发酵培养基来达到高产脂肪酸的目的，虽然培养基配方简单，能源利用高，利于工业化生产，但是所产总脂肪酸含量不高，且棕榈酸和DHA的含量均低于0.6g/L；或如专利(201911104758.9)中采用化学合成法合成顺
‑
11
‑
十六碳烯醛，虽然操作简单，反应条件温和，但是所产生的副产物会造成污染，不如生物制备法绿色安全。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种产顺
‑
11
‑
十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，突破微生物法产顺
‑
11
‑
十六碳烯的产量瓶颈。
[0006]本专利技术的技术方案概述如下：一种产顺
‑
11
‑
十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，其具体步骤如下：
[0007](1)取破囊壶菌于活化培养基中得活化菌液，将活化后的菌液离心，去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；
[0008](2)在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液均匀平铺在固体培养皿中，平铺量为1.5～2mL/cm2，进行氮离子注入诱变，注入能量为20～40keV，氮离子注入量为5～50
×
10
14
ions/cm2；
[0009](3)将步骤(2)中经过氮离子注入诱变的菌液用无菌生理盐水稀释体积50～150倍，取稀释后的菌液均匀涂布在M4固体平板培养基上，涂布的量为50～100μL/cm2，放入培养箱中培养；
[0010](4)于M4平板上挑选出单菌落作为初筛菌；
[0011](5)将步骤(4)中获得的初筛菌进行发酵培养，得到能稳定产顺
‑
11
‑
十六碳烯醛的
破囊壶菌菌株。
[0012]优选步骤(1)中所述的活化培养基的成分为：葡萄糖50～55g/L、无水乙醇5～8g/L，酵母提取物2～3g/L、K2HPO
4 0.2～0.3g/L，人工海盐13～14g/L、蛋白胨0.1～0.2g/L。
[0013]优选步骤(1)中活化培养条件为：在温度28～30℃，转速160～180rpm，pH为6.5～7.5条件下培养3～6天。
[0014]优选步骤(3)中放入培养箱中培养条件为15～30℃中恒温培养24～48h。
[0015]优选步骤(3)中M4培养基成分为：葡萄糖20～22g/L，蛋白胨1.5～2g/L，酵母提取物1.0～2.0g/L，人工海盐33～36g/L，琼脂粉20～25g/L。
[0016]优选步骤(5)中发酵培养条件为：温度为15～30℃、转速为200～250r/min，培养时间为4～6天。
[0017]有益效果：
[0018]本专利技术所涉及的破囊壶菌培育方法操作简单、效率高、成本低，在实际中易于操作。经过本专利技术方法所获得的破囊壶菌菌株，较野生型破囊壶菌顺
‑
11
‑
十六碳烯醛产量提高最多可达65.18％，远超同类方法，能够产生巨大的经济效益。
具体实施方式
[0019]以下结合具体实例对本专利技术做进一步的说明，本专利技术以破囊壶菌(Aurantiochytrium sp.NJTU
‑
63菌，购买自宁波明舟生物科技有限公司)为例，但并不对本专利技术做任何限制，其他野生型破囊壶菌也适用于本专利技术。
[0020]实施例1：
[0021]一种产顺
‑
11
‑
十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，包括如下步骤：
[0022](1)挑取破囊壶菌于活化培养基中，培养基成分为：葡萄糖50g/L、无水乙醇8g/L，酵母提取物3g/L、K2HPO
4 0.2g/L，人工海盐14g/L、蛋白胨0.1g/L在温度28℃，转速160rpm，pH为6.5条件下培养3天，得活化菌液，将活化后的菌液离心，去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107CFU/mL的菌悬液；
[0023](2)在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液均匀平铺在固体培养皿中，平铺量为1.5mL/cm2，进行氮离子注入诱变，注入能量为20keV，氮离子注入量为5
×
10
14
ions/cm2；
[0024](3)将步骤(2)中经过氮离子注入诱变的菌液用无菌生理盐水稀释体积50倍，取50μL/cm2均匀涂布在M4培养基上，M4培养基成分为：葡萄糖22g/L，蛋白胨1.5g/L，酵母提取物2.0g/L，人工海盐33g/L，琼脂粉25g/L，15℃中恒温培养48h；
[0025](4)于M4平板上挑选出单菌落作为初筛菌；
[0026](5)将步骤(4)中获得的初筛菌进行发酵培养，在15℃、200r/min培养6天，检测其生物量及顺
‑
11
‑
十六碳烯醛产量。
[0027]检测发酵后菌株生物量：收集10mL上述步骤(5)获得的菌液，于已称重的离心管内，12000r/min离心10min，去上清，离心管中剩余沉淀物用生理盐水清洗3次，置于冷冻干燥机中冻干，称量冻干后离心管重量，离心管冻干后的重量减去空离心管重量即为发酵液生物量。经过检测，筛选得到的菌株生物量较野生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产顺
‑
11
‑
十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，其具体步骤如下：(1)取破囊壶菌于活化培养基中得活化菌液，将活化后的菌液离心，去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；(2)在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液均匀平铺在固体培养皿中，平铺量为1.5～2mL/cm2，进行氮离子注入诱变，注入能量为20～40keV，氮离子注入量为5～50
×
10
14
ions/cm2；(3)将步骤(2)中经过氮离子注入诱变的菌液用无菌生理盐水稀释体积50～150倍，取稀释后的菌液均匀涂布在M4培养基上，涂布的量为50～100μL/cm2，放入培养箱中培养；(4)于M4平板上挑选出单菌落作为初筛菌；(5)将步骤(4)中获得的初筛菌进行发酵培养，得到能稳定产顺
‑
11
‑
十六碳烯醛...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡永红，杨晶晶，崔子龙，赵芷若，郭宏康，叶竞灵，王志，汪婷，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：