一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法技术

本发明专利技术提供了一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法，属于医药生物材料技术领域。该方法从水产品无脊椎动物中提取纯化出副肌球蛋白，加入金属离子诱导副肌球蛋白之间的相互作用驱动自组装，制备成网状疏松多孔的副肌球蛋白水凝胶，可应用于创伤组织或骨骼修复材料的制备。本发明专利技术提供的制备方法得到的蛋白水凝胶不仅机械性能稳定、生物相容性好，且具有响应金属离子可逆调控的特性。本发明专利技术提供的方法制备工艺简单，能够大规模的生产副肌球蛋白水凝胶，在生物材料领域有着广泛的应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法


[0001]本专利技术属于生物材料
，具体涉及到一种金属离子诱导副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法。

技术介绍

[0002]水产品养殖为人类提供优质蛋白，带来巨大的经济效益，副肌球蛋白广泛存在于无脊椎动物水产品中。比较有代表性的非脊椎动物水产养殖品类包括牡蛎、鲍鱼、虾等，其养殖场广泛地分布在世界各地。肌肉蛋白主要由肌原纤维蛋白、肌浆蛋白和肌基质蛋白组成。副肌球蛋白是无脊椎动物所特有的肌肉蛋白组分，是肌原纤维蛋白粗丝的重要组成部分。在牡蛎闭壳肌、鲍鱼、虾肌肉中副肌球蛋白含量较高。在生理状态下，副肌球蛋白主要由a螺旋组成，分子量约为99kDa，通常以二聚体的形式存在，两条a螺旋相互缠绕构成卷曲螺旋。目前，虽然副肌球蛋白的生物学功能还不是很清楚，但是它被认为与双壳类动物的闭壳过程有关，主要是相互聚集的副肌球蛋白能够在较低的能量消耗下将壳在长时间处于紧闭状态。
[0003]水凝胶是一种亲水性的三维网状结构材料，含水量高。蛋白水凝胶是以蛋白质或者蛋白质和其他聚合物为构建单元形成，蛋白质这些大分子许多特性使蛋白质水凝胶具有多种功能。蛋白水凝胶具有的生物相容性、生物可降解性等优点，与天然组织和器官相似的机械性能以及对环境的响应能力，使得蛋白水凝胶在组织修复、药物包埋递送、生物传感器、人工肌肉等生物医学方面有着广泛的应用。
[0004]副肌球蛋白卷曲螺旋的蛋白结构使其具备一定的凝胶特性。有文献报道，副肌球蛋白在较高温度时可以形成蛋白凝胶，并且具有较高的凝胶强度，然而在低温状态下，结果却相反。但是通过加热使副肌球蛋白变性而形成凝胶，破坏了天然的蛋白质结构，造成在生物材料以及再生医学应用方面具有一定的而局限性。因此，有必要开发一种基于非变性方法制备可逆调控、可注射的副肌球蛋白水凝胶的方法，对提高其在生物医药领域的实际应用具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的是在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种金属离子诱导副肌球蛋水凝胶的制备及解离方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]将提取纯化的副肌球蛋白溶液置于透析袋中，在含有金属离子的缓冲溶液中搅拌透析进行交联，将透析后的溶液置于离心管中离心，去除上清溶液，得到副肌球蛋白水凝胶；将所得水凝胶通过透析或者螯合剂去除金属离子可以实现水凝胶解离。
[0008]优选的，副肌球蛋白来源于牡蛎、鲍鱼、虾等水产品养殖非脊椎动物。
[0009]优选的，所述蛋白溶液中副肌球蛋白的浓度在1～10mg/mL。
[0010]优选的，所述蛋白溶液溶解在含NaCl的缓冲溶液中，缓冲体系为10～20 mMTris、
HEPES、PBS或者MOPS溶液，NaCl浓度在150～200mM，蛋白溶液的pH为6.0～9.0。
[0011]优选的，所述装有蛋白溶液的透析袋分子量为10～100KD。
[0012]优选的，所述的搅拌装置为磁力搅拌器，转速为50
‑
200rpm。
[0013]优选的，所述的金属离子为Zn
2+
、Cu
2+
、Ni
2+
、Co
2+
、Fe
3+
、Mg
2+
，金属离子的浓度为20～100μM。
[0014]优选的，所述的透析缓冲液为10～50mM的Tris、HEPES、PBS或者MOPS，缓冲液的pH为6.0～9.0。
[0015]优选的，所述的交联反应条件为透析时间为4～12h，透析3～4次，透析的温度为4～25℃。
[0016]优选的，所述的离心条件为8000～12000rpm离心2～10min。
[0017]优选的，所述凝胶解离透析缓冲液为10～50mM的Tris、HEPES、PBS 或者MOPS，缓冲液的pH为6.0～9.0，缓冲液中不含金属离子。
[0018]优选的，所述凝胶解离金属螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二羟乙基甘氨酸(DEG) 等，浓度为50μM～100mM。
[0019]本专利技术提供一种副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法，采用上述技术方案中所述的方法实现。
[0020]本专利技术提供一种金属离子副肌球蛋白水凝胶的制备及解离方法，通过在反应液中加入微摩级的金属离子，金属离子可以与副肌球蛋白中所含的组氨酸、谷氨酸金属配位，基于配体
‑
金属配位键的交联点，使副肌球蛋白分子之间相互交联形成蛋白水凝胶，通过去除金属离子可以实现水凝胶解离，所制备水凝胶具有可逆调控的能力，通过水凝胶可逆组装可以实现活性物质的包埋。较目前有关通过加热的方法来制备副肌球蛋白水凝胶，本专利技术能够保持蛋白在天然活性状态形成水凝胶，制备出具有良好生物相容性和生物可降解性以及可逆可注射的副肌球蛋白凝胶。本专利技术可降低成本，节约能源，符合社会经济可持续发展的目标。这能扩大副肌球蛋白凝胶的应用潜力，适合于生物医学、组织工程等领域。
附图说明
[0021][0022]图1为制备的可逆调控的副肌球蛋白水凝胶的实物图；
[0023]图2为制备的金属离子诱导的副肌球蛋白水凝胶冷冻干燥后的扫描电镜结构图。
具体实施方式
[0024]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]实施例1
[0026]本专利技术提供一种牡蛎副肌球蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0027]1)取若干只太平洋长牡蛎闭壳肌组织，将闭壳肌切成小块组织，于0.15 M pH6.5磷酸盐缓冲溶液中绞碎，冰上均质，离心弃上清；
[0028]2)沉淀用预冷的50mM NaHCO3溶液溶解，低温搅拌,离心弃上清；
[0029]3)沉淀用预冷的无菌水溶解，低温搅拌,离心弃上清；
[0030]4)沉淀用
‑
20℃预冷的丙酮溶解，室温搅拌，离心弃上清，将沉淀用同样的方法再处理3次，最后将收集的沉淀室温过夜干燥，获得的丙酮粉。
[0031]5)在丙酮粉加入20mL Buffer G(2mM Tris，0.2mM CaCl2，0.2mMATP
‑
Na2，0.5mM β
‑
巯基乙醇pH 8.0)在冰上搅拌，离心收集上清，用DEAE 离子交换层析纯化出副肌球蛋白。
[0032]6)将提取纯化的2mg/mL副肌球蛋白溶液置于透析袋中，在100μMZnCl2，20mM HEPES pH8.0的缓冲溶液中室温搅拌透析4h，将透析后的溶液置于离心管中离心，去除上清溶液，得到副肌球蛋白水凝胶。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金属离子诱导的副肌球蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将副肌球蛋白溶液置于透析袋中，在含有金属离子的缓冲液中搅拌透析，将透析后的溶液置于离心管中离心，去除上清溶液，即得副肌球蛋白水凝胶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述副肌球蛋白溶液的浓度为1～10mg/mL。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为150～500mMNaCl溶液或者10～50mMHEPES溶液。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述副肌球蛋白溶液pH为6.0～9.0。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的透析袋的分子量为10～100KD。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的金属离子为Zn
2+
、Cu
2+
、Ni
2+
、Co
2+
、Fe
3+
与Mg
2+
中的一种或多种，金属离子的浓度为20～100μM。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的透析缓冲液为10～50mM的HEPES、Tris
‑
HCl、PBS或者MOPS，缓冲液的pH为6.0～9.0。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述透析用的透析装置为磁力搅拌...

【专利技术属性】
技术研发人员：张拓，尹术华，赵广华，吕晨艳，臧佳辰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：