一种PD-L1外泌体电化学传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种PD

【技术实现步骤摘要】
一种PD
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L1外泌体电化学传感器及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及电化学传感器，尤其涉及PD
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L1外泌体电化学传感器。

技术介绍

[0002]免疫系统对机体的免疫反应和功能起着重要的作用，可维持机体内部环境的平衡和稳定。免疫逃逸机制被认为是诱发癌症的关键因素之一。
[0003]程序性死亡配体1(PD
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L1)是调节T细胞免疫应答的主要分子之一。PD
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1和PD
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L1都是属于CD28/B7/CTLA
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4蛋白家族的I型跨膜蛋白。PD
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L1由一个含有IgC样和IgV样结构域的细胞外结构、一个疏水性跨膜结构域和一个短胞内结构域组成。其组成性低表达位于抗原呈递细胞、血管内皮细胞和免疫特权组织(如胎盘、睾丸、眼睛)或其他部位。PD
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L1也可能因致癌过程中的驱动致癌事件而过度表达，PD
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L1生物学功能的实现主要取决于对PD
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1的特异性识别。PD
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1主要表达于成熟淋巴细胞和骨髓细胞的细胞膜表面，由疏水跨膜结构域、胞外IgV样结构域和胞内结构域组成，其中存在两个酪氨酸残基，为N端酪氨酸抑制基序(ITIM)和C端酪氨酸转换基序(ITSM)。PD
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L1在许多恶性肿瘤中呈高水平表达，如黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌等，提示PD
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L1参与肿瘤的发生发展，在减弱抗肿瘤免疫反应中起重要作用。目前，现有的文献指出PD
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L1外泌体在疾病诊断过程与疾病进程相关。因此，PD
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L1外泌体的检测成为多种肿瘤免疫治疗的重要指标。对于PD
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L1外泌体的临床检测对肿瘤的早期诊断、诊疗方案的确定、治疗剂量的优化以及药物疗效的评价具有重要意义。
[0004]虽然最常用的肿瘤检测免疫组化(IHC)可以直观地评估病变组织的生理和病理状况，但这种侵入性诊断方法依赖于医生的主观判断来评估患者是否患有癌症，这可能会导致假阳性诊断结果。此外，组织切片厚度、抗体孵育时间、染色程度等IHC的前期操作都会影响诊断结果。因此在诊断过程中需要更客观的辅助方式来综合评估患者的病情，如PD
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L1外泌体浓度的精确数字。有多种新兴的PD
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L1检测方法。如可测量原发灶和转移灶中PD
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L1表达的放射性核素标记核医学影像、具有快速检测和多样本分析优势的流式细胞术等，均可作为IHC的辅助手段诊断癌症。实验室常规的聚合酶链反应(PCR)技术可直接在核酸水平特异性检测sPD
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L1基因。蛋白质是生物功能的执行者，而基因表达水平与蛋白质表达水平之间没有绝对对应关系，所以通过基因检测很难准确反映病理状态，并且由于其成本较高，一直受到很大的限制。而且现有方法依旧不能将PD
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L1外泌体低表达的患者与健康人区分开，也不能预测部分患者(约15％的患者)的临床结果，灵敏度还有待提高。并且PD
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L1外泌体在人血清和各种体液中的低表达程度影响了PD
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L1外泌体检测的准确性，PD
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L1外泌体的定量需要更高的灵敏度、更快的响应速度和更准确的诊断结果。鉴于这种现状，迫切需要开发一种有效的PD
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L1外泌体检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供超灵敏的免疫电化学传感器。用以实现对PD
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L1外泌体的检测。本专利技术的目的之二在于提供该传感器的制备方法。
[0006]为达到上述目的，本方法的本专利技术采用如下机理：电化学分析具有灵敏度高、无需标记、实时监测和技术廉价等优点，为外泌体疾病标志物的医学诊断提供了巨大的潜力。肽在分析检测中作为识别分子具有优势，但它们的亲和力和选择性比抗体弱。因此，上述识别探针限制了开发测定的灵敏度。同时，用修饰电极直接检测临床样品中的目标分子，会引发蛋白质非特异性吸附引起的生物污染，降低生物测定的灵敏度和准确性。多价相互作用是克服探针弱结合亲和力的主要策略，本专利技术提出具有多个分支序列的肽可以提高肽探针对靶标结合亲和力，同时提高防污性能。
[0007]本专利技术设计了一种简便且灵敏的电化学传感器来定量PD
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L1外泌体的水平。模拟蟹爪防污肽电极界面，用于血清中高灵敏度和简便的PD
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L1外泌体检测。由于多种原因，蟹爪多价防污肽对PD
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L1外泌体的结合亲和力高于直链肽。识别探针的增强提高了界面与靶点的相互作用的可能性。最重要的是，单肽上的多识别分子和多个受体之间的互作显着改善了结合亲和力。同时，基于EKEKEK的多状防污结构，进一步提高了传感器的防污能力，减少了BSA等防污蛋白加入的步骤。Zr
4+
和AgNCs的先后加入，实现高选择性和稳定结合，不受蛋白变性的干扰，并且进一步提高了PD
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L1外泌体的检测灵敏度和高特异性。通过这种模式，一种高效的“互作识别”策略被构建出来。
[0008]为实现上述目的，本专利技术首先提供了一种PD
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L1外泌体电化学传感器，其传感器电极由蟹爪多价防污肽{[(NYSKPTDRQYHFKE)4]KE}2KEPPPPC进行功能化修饰。
[0009]进一步地，修饰步骤为：将蟹爪多价防污肽溶液加入TCEP后，加入至电极界面进行反应后，用缓冲液洗涤金电极表面。
[0010]本专利技术还提供了一种PD
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L1外泌体电化学传感器的制备方法，用蟹爪多价防污肽{[(NYSKPTDRQYHFKE)4]KE}2KEPPPPC对传感器电极进行功能化修饰，修饰步骤为：将蟹爪多价防污肽溶液加入TCEP后，加入至电极界面进行反应，然后用缓冲液洗涤金电极表面。
[0011]进一步地，反应时间约1小时。
[0012]本专利技术最后提供了一种PD
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L1外泌体电化学传感器的应用，包括步骤：
[0013](1)用蟹爪多价防污肽{[(NYSKPTDRQYHFKE)4]KE}2KEPPPPC对传感器电极进行功能化修饰；
[0014](2)靶标溶液中加入电极界面进行孵育；
[0015](3)在电极界面加入Zr
4+
和AgNCs孵育；
[0016](4)将电极安装到电化学工作站仪器上，通过电化学DPV检测PD
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L1外泌体。
[0017]进一步地，修饰步骤为：将蟹爪多价防污肽溶液加入TCEP后，加入至电极界面进行反应，然后用缓冲液洗涤金电极表面。
[0018]进一步地，反应时间约1小时。
[0019]进一步地，AgNCs的合成步骤为：在AgNO3溶液中加入柠檬酸三钠溶液在室温下搅拌，然后加入NaBH4并在黑暗中反应以获得AgNCs本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PD
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L1外泌体电化学传感器，其特征在于，其传感器电极由蟹爪多价防污肽{[(NYSKPTDRQYHFKE)4]KE}2KEPPPPC进行功能化修饰。2.如权利要求1所述的PD
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L1外泌体电化学传感器，其中，修饰步骤为：将蟹爪多价防污肽溶液加入TCEP后，加入至电极界面进行反应后，用缓冲液洗涤金电极表面。3.一种PD
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L1外泌体电化学传感器的制备方法，其特征在于，用蟹爪多价防污肽{[(NYSKPTDRQYHFKE)4]KE}2KEPPPPC对传感器电极进行功能化修饰，修饰步骤为：将蟹爪多价防污肽溶液加入TCEP后，加入至电极界面进行反应，然后用缓冲液洗涤金电极表面。4.如权利要求1所述的PD
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L1外泌体电化学传感器的制备方法，其中，反应时间约1小时。5.一种PD
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L1外泌体电化学传感器的应用，其特征在于，包括步骤：(1)用蟹爪多价防污肽{[(NYSKPTDRQYHFKE)4]KE}2KEPPPPC对传感器电极进行功能化修饰；(2)靶标溶液中加入电极界面进行孵育；(3)在电极界面加入Zr
4+
和AgNCs孵育；(4)将电极安装到电化学工作站仪器上，通过电化学DPV检测PD

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红霞，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
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