用于侦测精子DNA片段化的方法以及试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于侦测精子DNA片段化的方法以及试剂盒。本发明专利技术揭示一种用于侦测一精液样品中的精子的DNA片段化的方法，其包含下列步骤：对该精液样品进行凝胶包埋处理、DNA变性处理与裂解处理，而使得所述精子的DNA被变性以及核蛋白被裂解，其中该裂解处理是通过使用一包含有尿素与十二烷基硫酸钠的裂解液而被进行；令该经裂解处理的凝胶进行一DNA染色；以及观察在该经染色的凝胶上是否有光晕形成于各个精子的头部外围，其中无光晕存在或光晕宽度小于该精子头部直径的1/3是精子DNA片段化存在的表征。本发明专利技术亦揭示一种用于进行该方法的试剂盒。试剂盒。试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
用于侦测精子DNA片段化的方法以及试剂盒


[0001]本专利技术是有关于用于侦测一精液样品中的精子的DNA片段化的方法。本专利技术亦有关于用于进行该方法的试剂盒。

技术介绍

[0002]精子DNA(sperm DNA)的完整性是影响胚胎质量(embryo quality)、胚胎着床(embryo implantation)以及胚胎发育(embryo development)的主要因素之一。当精子DNA因精子形成(spermiogenesis)发生错误、精子凋亡(sperm apoptosis)、氧化性压力(oxidative stress)或辐射(radiation)等因素而断裂成片段(包括单
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与双
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链DNA断裂)，亦即精子DNA片段化(sperm DNA fragmentation,SDF)，会造成男性不孕症(male infertility)、体外人工授精(IVF)失败[in vitro fertilization(IVF)failure]以及流产(miscarriage)的发生。因此，精子DNA片段化的侦测已在生育力的筛检以及人工生殖治疗(artificial reproduction treatments)中扮演重要的角色。
[0003]目前现有可用来侦测精子DNA片段化的方法包括：精子染色质结构分析(sperm chromatin structure assay,SCSA)、末端脱氧核糖核苷酸转移酶调节的dUTP切口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)分析、DNA断裂侦测
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荧光原位杂交(DBD
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FISH)试验[DNA Breakage Detection
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Fluorescence in Situ Hybridization(DBD
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FISH)test]、彗星试验(comet assay,CA)以及精子染色质扩散(SCD)试验[sperm chromatin dispersion(SCD)test]，其中又以SCD试验最广为人使用。
[0004]SCD试验主要是在对精子进行琼脂糖凝胶(agarose gel)的包埋后，使用DNA变性溶液(DNA denaturing solution)来限制性地将精子中的双链DNA转化成单链DNA，继而再裂解精子中的核蛋白(nuclear proteins)[包括鱼精蛋白(protamine)]，此时DNA会因鱼精蛋白的裂解而松开形成DNA环(DNA loops)，DNA环的大小与DNA的完整程度呈正相关。接着，在进行DNA染色后，这些DNA环会形成大小不一的光晕(halo)，其中当光晕宽度大于或等于精子头部直径的1/3，代表无DNA片段化，而当无光晕或光晕宽度小于精子头部直径的1/3，代表有DNA片段化。然而，SCD试验存在有操作较为繁杂并且费时的缺点。此外，若试验时间过长，精子的尾部可能会呈现卷曲，并且会随着时间的增加而更趋于明显，且因有些精液样品中存在有白血球，白血球在经过SCD试验后亦会有光晕形成，而容易与尾部呈现卷曲的精子混淆，导致在结果判读上变得困难。
[0005]因此，本技艺中仍然存在有一需要去发展出一种操作方便快速且可靠的侦测方法来供产业界之所需。

技术实现思路

[0006]于是，在第一个方面，本专利技术提供一种用于侦测一精液样品中的精子的DNA片段化的方法，其包含下列步骤：
[0007](a)令该精液样品包埋于一凝胶，借此而得到一包埋有精子的凝胶，其中该凝胶包含有一选自于由下列所构成的群组中的成分：琼脂糖、丙烯酰胺、海藻酸盐以及氯乙烯；
[0008](b)以一DNA变性溶液来对该包埋有精子的凝胶进行一DNA变性处理，而使得所述精子的DNA被变性；
[0009](c)以一裂解液来对该经DNA变性处理的凝胶进行一裂解处理，而使得所述精子的核蛋白被裂解，其中该裂解液包含有具有一浓度范围落在0.5至4M内的尿素以及具有一浓度范围落在0.05至0.5％(w/v，g/mL)内的十二烷基硫酸钠；
[0010](d)令该经裂解处理的凝胶进行一DNA染色；以及
[0011](e)观察在该经染色的凝胶上是否有光晕形成于各个精子的头部外围，其中无光晕存在或光晕宽度小于该精子头部直径的1/3是精子DNA片段化存在的表征。
[0012]较佳地，在步骤(a)中，该凝胶进一步包含有一选自于由下列所构成的群组中的酸碱指示剂：酚红、甲基紫、甲基橙、甲基红、刚果红，以及它们的组合。
[0013]在第二个方面，本专利技术提供一种用于侦测一精液样品中的精子的DNA片段化的方法，其包含下列步骤：
[0014](a)令一琼脂糖进行一加热处理，接着混合以一DNA变性溶液与该精液样品，继而对所形成的混合物进行一凝胶聚合作用，借此而得到一包埋有经DNA变性的精子的凝胶；
[0015](b)以一裂解液来对该包埋有经DNA变性的精子的凝胶进行一裂解处理，而使得所述精子的核蛋白被裂解，其中该裂解液包含有具有一浓度范围落在0.5至4M内的尿素以及具有一浓度范围落在0.05至0.5％(w/v，g/mL)内的十二烷基硫酸钠；
[0016](c)令该经裂解处理的凝胶进行一DNA染色；以及
[0017](d)观察在该经染色的凝胶上是否有光晕形成于各个精子的头部外围，其中无光晕存在或光晕宽度小于该精子头部直径的1/3是精子DNA片段化存在的表征。
[0018]较佳地，在步骤(a)中，琼脂糖在被进行加热处理前有被预混合以一选自于由下列所构成的群组中的酸碱指示剂：酚红、甲基紫、甲基橙、甲基红、刚果红，以及它们的组合。
[0019]在第三个方面，本专利技术提供一种用于侦测一精液样品中的精子的DNA片段化的方法，其包含下列步骤：
[0020](a)令该精液样品、一DNA变性溶液以及一胶体形成成分进行混合，继而对所形成的混合物进行一凝胶聚合作用，借此而得到一包埋有经DNA变性的精子的凝胶，其中该胶体形成成分是选自于由下列所构成的群组：丙烯酰胺、海藻酸盐以及氯乙烯；
[0021](b)以一裂解液来对该包埋有经DNA变性的精子的凝胶进行一裂解处理，而使得所述精子的核蛋白被裂解，其中该裂解液包含有具有一浓度范围落在0.5至4M内的尿素以及具有一浓度范围落在0.05至0.5％(w/v，g/mL)内的十二烷基硫酸钠；
[0022](c)令该经裂解处理的凝胶进行一DNA染色；以及
[0023](d)观察在该经染色的凝胶上是否有光晕形成于各个精子的头部外围，其中无光晕存在或光晕宽度小于该精子头部直径的1/3是精子DNA片段化存在的表征。
[0024]较佳地，在步骤(a)中，该混合物进一步包含有一选自于由下列所构成的群组中的酸碱指示剂：酚红、甲基紫、甲基橙、甲基红、刚果红，以及它本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于侦测一精液样品中的精子的DNA片段化的方法，其特征在于：该方法包含下列步骤：(a)令该精液样品包埋于一凝胶，借此而得到一包埋有精子的凝胶，其中该凝胶包含有一选自于由下列所构成的群组中的成分：琼脂糖、丙烯酰胺、海藻酸盐以及氯乙烯；(b)以一DNA变性溶液来对该包埋有精子的凝胶进行一DNA变性处理，而使得所述精子的DNA被变性；(c)以一裂解液来对该经DNA变性处理的凝胶进行一裂解处理，而使得所述精子的核蛋白被裂解，其中该裂解液包含有具有一浓度范围落在0.5至4M内的尿素以及具有一浓度范围落在0.05至0.5％(w/v，g/mL)内的十二烷基硫酸钠；(d)令该经裂解处理的凝胶进行一DNA染色；以及(e)观察在该经染色的凝胶上是否有光晕形成于各个精子的头部外围，其中无光晕存在或光晕宽度小于该精子头部直径的1/3是精子DNA片段化存在的表征。2.根据权利要求1所述的用于侦测一精液样品中的精子的DNA片段化的方法，其特征在于：在步骤(a)中，该凝胶进一步包含有一选自于由下列所构成的群组中的酸碱指示剂：酚红、甲基紫、甲基橙、甲基红、刚果红，以及它们的组合。3.一种用于侦测一精液样品中的精子的DNA片段化的方法，其特征在于：该方法包含下列步骤：(a)令一琼脂糖进行一加热处理，接着混合以一DNA变性溶液与该精液样品，继而对所形成的混合物进行一凝胶聚合作用，借此而得到一包埋有经DNA变性的精子的凝胶；(b)以一裂解液来对该包埋有经DNA变性的精子的凝胶进行一裂解处理，而使得所述精子的核蛋白被裂解，其中该裂解液包含有具有一浓度范围落在0.5至4M内的尿素以及具有一浓度范围落在0.05至0.5％(w/v，g/mL)内的十二烷基硫酸钠；(c)令该经裂解处理的凝胶进行一DNA染色；以及(d)观察在该经染色的凝胶上是否有光晕形成于各个精子的头部外围，其中无光晕存在或光晕宽度小于该精子头部直径的1/3是精子DNA片段化存在的表征。4.根据权利要求3所述的用于侦测一精液样品中的精子的DNA片段化的方法，其特征在于：在步骤(a)中，琼脂糖在被进行加热处理前有被预混合以一选自于由下列所构成的群组中的酸碱指示剂：酚红、甲基紫、甲基橙、甲基红、刚果红，以及它们的组合。5.一种用于侦测一精液样品中的精子的DNA片段化的方法，其特征在于：该方法包含下列步骤：(a)令该精液样品、一DNA变性溶液以及一胶体形成成分进行混合，继而对所形成的混合物进行一凝胶聚合作用，借此而得到一包埋有经DNA变性的精子的凝胶，其中该胶体形成成分是选自于由下列所构成的群组：丙烯酰胺、海藻酸盐以及氯乙烯；(b)以一裂解液来对该包埋有经DNA变性的精子的凝胶进行一裂解处理，而使得所述精子的核蛋白被裂解，其中该裂解液包含有具有一浓度范围落在0.5至4M内的尿素以及具有一浓度范围落在0.05至0.5％(w/v，g/mL)内的十二烷基硫酸钠；(c)令该经裂解处理的凝胶进行一DNA染色；以...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振腾，张立昇，李琇琴，
申请(专利权)人：邦睿生技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：