测量核酸修饰酶活性的测定制造技术

本申请公开了一种测量核酸修饰酶活性并筛选酶促反应的一个或多个可变元件的多重化方法。该方法包括：(i)提供编码DNA/RNA靶位点和待测试的可变元件例如核酸修饰酶变体的多核苷酸构建体文库，(ii)将多核苷酸构建体的单拷贝与体外转录翻译(IVVT)试剂一起分区，(iii)允许在每个隔室中表达核酸修饰酶和DNA/RNA靶位点的IVVT反应，(iv)取决于编码的核酸修饰酶的功能性，单个多核苷酸构建体/RNA靶标被裂解、保持完整或以其他方式被修饰，和(v)通过测序对裂解的、完整的或修饰的多核苷酸构建体/RNA靶标定量，从而直接鉴定与每个可变元件相关的酶活性并对该酶活性定量。特别地，核酸修饰酶是CRISPR相关蛋白(Cas)。修饰酶是CRISPR相关蛋白(Cas)。修饰酶是CRISPR相关蛋白(Cas)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测量核酸修饰酶活性的测定
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年10月15日提交的新加坡临时申请号10201909632P的优先权的权益，其内容以全文引用的方式并入本文以用于所有目的。


[0003]本专利技术涉及生物
，特别是适用于测量酶活性的多重化测定(multiplex assay)的开发。

技术介绍

[0004]核酸修饰酶，如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关核酸酶已成为生物医学研究和生物技术行业中极有用的工具。作为治疗方式，这些核酸修饰酶可以通过直接修饰DNA或RNA来治疗以前无法治愈的遗传疾病。为了实现核酸修饰酶的巨大工业和医学潜力，必须解决天然存在的组分的局限性。这些局限性包括靶向效率、靶向特异性、免疫原性以及与递送载体和赋予功能的蛋白质融合部分的相容性问题。为了解决这些局限性，必须在称为蛋白质工程化的过程中对酶进行修饰并测定酶活性。通过改变蛋白质氨基酸序列或将赋予功能的蛋白质结构域融合/共定位到Cas蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种方法，包括以下步骤：a)将多个多核苷酸构建体分隔到隔室中，其中每个隔室包含单个多核苷酸构建体，其中每个多核苷酸构建体包含i)可操作地连接至第一启动子的编码核酸修饰酶或其变体的第一多核苷酸序列；和ii)包含DNA靶标或编码RNA靶标的DNA模板的第二多核苷酸序列，其中当所述第二多核苷酸序列包含编码RNA靶标的DNA模板时，所述RNA靶标与所述核酸修饰酶作为单个RNA转录物被所述第一启动子驱动而连续共表达；并且其中所述多个多核苷酸构建体编码所述核酸修饰酶的不同变体，和/或不同的DNA或RNA靶标；b)使所述隔室经受允许RNA和蛋白质的体外表达的条件；c)使多个所述隔室经受允许通过对DNA或RNA靶标具有修饰活性的核酸修饰酶修饰所述DNA/RNA靶标的条件，从而产生包含以下中的一个或多个的DNA/RNA分子群体：v.已被所述核酸修饰酶修饰的多核苷酸构建体和/或RNA转录物或其片段；vi.未被所述核酸修饰酶修饰的多核苷酸构建体和/或RNA转录物；d)收获步骤(c)中产生的所述DNA/RNA分子群体，并对其进行单分子测序；e)基于测序结果对步骤c)i和c)ii中提到的DNA/RNA分子进行检测和计数。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸修饰酶是RNA引导的核酸修饰酶，每个隔室还包含向导RNA或编码其的核苷酸模板。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸修饰酶是RNA引导的核酸修饰酶，每个多核苷酸还包含编码变体向导RNA(gRNA)的第三多核苷酸序列；并且其中所述多个多核苷酸构建体编码所述核酸修饰酶的不同变体，和/或不同的DNA或RNA靶标，和/或不同的gRNA。4.一种方法，包括以下步骤：a)将多个多核苷酸构建体分隔到隔室中，其中每个隔室包含单个多核苷酸构建体，其中每个多核苷酸构建体包含：i)可操作地连接至第一启动子的编码向导RNA(gRNA)的第一多核苷酸序列；ii)包含DNA靶标或编码RNA靶标的DNA模板的第二多核苷酸序列，其中当所述第二多核苷酸序列包含编码RNA靶标的DNA模板时，所述RNA靶标与所述gRNA作为单个RNA转录物被所述第一启动子驱动而连续共表达；其中所述多个多核苷酸构建体编码不同的gRNA，和/或不同的DNA或RNA靶标；并且其中每个隔室还包含RNA引导的核酸修饰酶或其变体或编码其的核苷酸模板；b)使所述隔室经受允许RNA和蛋白质的体外转录和/或翻译的条件；c)使所述隔室经受允许通过对DNA或RNA靶标具有功能活性的RNA引导的核酸修饰酶在gRNA存在下修饰所述DNA和/或RNA靶标的条件，从而产生包含以下中的一个或多个的DNA/RNA分子群体：iii.已被所述核酸修饰酶修饰的多核苷酸构建体和/或RNA转录物或其片段；iv.未被所述核酸修饰酶修饰的多核苷酸构建体和/或RNA转录物；d)收获步骤(c)中产生的所述DNA/RNA分子群体，并对其进行单分子长读段测序；e)基于测序结果对步骤c)i和/或c)ii中提到的DNA/RNA分子进行检测和计数。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括评估一种或多种核酸
修饰酶对一个或多个所述DNA/RNA靶标的修饰活性，所述评估通过以下方式进行：计算已被所述核酸修饰酶修饰的多核苷酸构建体和/或RNA转录物的数量(∑计数
修饰
)，并将其与未被所述核酸修饰酶修饰的多核苷酸构建体和/或RNA转录物的数量(∑计数
未修饰
)或与多核苷酸构建体和/或RNA转录物的总数量(∑计数
修饰+未修饰
)进行比较。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶活性由使用以下公式中的任一个计算的值表示：1)酶活性≈∑计数
修饰
/∑计数
未修饰
；2)酶活性≈∑计数
修饰
/∑计数
修饰+未修饰
。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤d)还包括通过物理或化学方法破坏所述隔室。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤d)还包括纯化收获的DNA/RNA分子以从反应中去除过量的DNA、RNA和/或蛋白质。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中除了所述单分子测序所需的修饰以外，在对所述收获的DNA/RNA分子群体进行单分子测序反应之前不进行进一步修饰。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中对已被或未被所述核酸修饰酶修饰的DNA/RNA分子的检测和计数仅基于所述单分子测序期间产生的数据，并且不需要对所述DNA/RNA分子的进一步修饰或处理。11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述修饰活性是裂解活性，并且通过将所述DNA/RNA分子的测序读数与参考序列比对来实现对修饰和未修饰的多核苷酸构建体或RNA转录物的检测和计算，所述参考序列包含所述核酸修饰酶的裂解位点窗口，其中i)当DNA/RNA分子的3'端映射到所述裂解位点窗口3'下...

【专利技术属性】
技术研发人员：王庭训，赵伟良，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：