一种合成高纯度甘油二酯的酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于食品生物技术和油脂加工和综合利用领域，具体涉及一种合成甘油二酯的酶及其制备方法与应用；S2：重组质粒的构建：以S1中获得的Malassezia restricta脂肪酶MRL的基因序列为模板，利用上游引物F和下游引物R扩增脂肪酶MRL基因，经双酶切后与质粒pET30a连接，获得重组质粒pET30a

【技术实现步骤摘要】
一种合成高纯度甘油二酯的酶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于食品生物技术和油脂加工和综合利用领域，特别是指一种合成甘油二酯的酶及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]甘油二酯（Diacylcerol，DAG）是甘油中的两个羟基与脂肪酸酯化形成的结构脂质，主要包括1,2
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DAG和1,3
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DAG两种异构体，是公认安全（GRAS）的食品成分。甘油二酯的代谢途径和甘油三脂不同，其被人体摄入后经胰脂肪酶分解生成甘油和游离脂肪酸，可以直接转化为能量，并不参与血脂合成，因而不会引起血脂升高、引发肥胖。因此，甘油二酯可以作为保健油脂、医药中间体，在食品、医药、化工行业具有非常重要的应用价值。
[0003]甘油二酯，大都是以动植物油、甘油和脂肪酸为原料，通过水解、酯化、转酯化、酸解、醇解等反应制备出的不同DAG含量的产品。通常，甘油二酯的制备方法有三种：水解法、甘油解法与酯化法。水解法是采用具有sn
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1,3位特异性的脂肪酶适度水解精炼的动植物油脂获得甘油二酯，此方法制得的油脂经分子蒸馏纯化后DAG含量通常不超过60%。甘油解法，是采用游离酶或固定化酶，以精炼动植物油脂与甘油为底物，在溶剂或无溶剂体系下进行甘油解反应，此方法制备出的油脂中DAG含量通常在50
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85%之间，但是该反应受酶制剂的类型、溶剂、脂肪酶位置选择性等条件制约因素较大。酯化法则是采用具有sn
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1,3位特异性的脂肪酶或偏甘油酯脂肪酶，酯化甘油与脂肪酸获得富含DAG的油脂，此法制得的DAG含量高达90%以上，尤其是通过偏甘油酯脂肪酶酯化制得的油脂，其DAG含量可达到97%以上。因此，酯化法生产高纯度甘油二酯具有很大优势。
[0004]目前生产高纯度甘油二酯的偏甘油酯脂肪酶来源极少，商业化的具有sn
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1,3位特异性的偏甘油酯脂肪酶，该酶分别来自于嗜热真菌Thermomyces lanuginosus和青霉菌Penicillium camemberti，均是通过发酵生产，经纯化、干燥获得的粉末状游离型酶制剂，价格昂贵。国内仅有文献报道的偏甘油酯脂肪酶有脂肪酶SMG1、MgDL2和PCL等，但这些酶均未为应用于商业化生产甘油二酯。
[0005]为此，本专利技术提出一种合成高纯度甘油二酯的酶及其制备方法与应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对国内现有制备甘油二酯脂肪酶资源的不足，提出一种合成高纯度甘油二酯的酶及其制备方法与应用，确定最佳合成甘油二酯的条件，丰富国内用于酯化法生产甘油二酯的脂肪酶资源。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案。
[0008]一种合成高纯度甘油二酯的酶的制备方法，步骤如下：S1：通过合成海洋细菌Malassezia restricta脂肪酶MRL的基因；S2：重组质粒的构建：以S1中获得的Malassezia restricta脂肪酶MRL的基因序列为模板，利用上游引物F和下游引物R扩增脂肪酶MRL基因，经双酶切后与质粒pET30a连接，
获得重组质粒pET30a
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MRL。
[0009]S3：脂肪酶MRL蛋白表达菌株的构建：将重组质粒pET30a
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MRL导入大肠杆菌BL21中，筛选获得阳性转化子，即为脂肪酶MRL蛋白表达菌株。
[0010]S4：脂肪酶MRL蛋白表达与纯化：培养脂肪酶MRL蛋白表达菌株，诱导蛋白表达、纯化、干燥获得脂肪酶MRL干粉。
[0011]优选的，当油酸与甘油的底物摩尔比为1:1
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1:5，加酶量为底物总质量的2%
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10%，反应温度为25℃
ꢀ‑
50℃，反应2h
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20h后获得的油脂中甘油二酯的含量在30%
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50%之间，酯化率可以达到60%
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85%。
[0012]本专利技术具有如下有益效果：本专利技术制备的来源于海洋细菌Malassezia restricta的偏甘油酯脂肪酶MRL具有良好的酯化活性，可以高效催化甘油和脂肪酸形成甘油一酯和甘油二酯，酯化率达到60%
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85%，产物中甘油二酯含量达到30%
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50%，产物再次经过分子蒸馏后得到的高纯度油脂中含有80
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93%的甘油二酯，具有明显的工业化生产潜力。
附图说明
[0013]图1为脂肪酶MRL基因表达质粒构建示意图。
[0014]图2为脂肪酶MRL蛋白纯化电泳图。
[0015]图3为脂肪酶MRL添加量对酯化率和甘油酯含量的影响。
[0016]图中：M、为蛋白Marker；1、为全细胞裂解液；2、为上清蛋白；3、为细胞碎片；4、为Ni柱纯化后的蛋白；5、为脱盐后的蛋白。
具体实施方式
[0017]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0018]一种合成高纯度甘油二酯的酶的制备方法，步骤如下：S1：通过合成海洋细菌Malassezia restricta脂肪酶MRL的基因；S2：重组质粒的构建：以S1中获得的Malassezia restricta脂肪酶MRL的基因序列为模板，利用上游引物F和下游引物R扩增脂肪酶MRL基因，经双酶切后与质粒pET30a连接，获得重组质粒pET30a
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MRL。
[0019]S3：脂肪酶MRL蛋白表达菌株的构建：将重组质粒pET30a
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MRL导入大肠杆菌BL21中，筛选获得阳性转化子，即为脂肪酶MRL蛋白表达菌株。
[0020]S4：脂肪酶MRL蛋白表达与纯化：培养脂肪酶MRL蛋白表达菌株，诱导蛋白表达、纯化、干燥获得脂肪酶MRL干粉。
[0021]（1）菌株、酶与培养基大肠杆菌Escherichia coli Top10和大肠杆菌Escherichia coli BL21化学感受态细胞；DNA聚合酶（Ex Taq DNA polymerase）购自大连Takara公司，DNA连接酶（T4 DNA ligase）和限制性内切酶NdeI和HindIII购自Thermo Fisher Scientific；LB培养基组成成分为Tryptone 10 g/L,Yeast extract 5 g/L, NaCl 10 g/L；卡那霉素浓度为50 ug/mL；表达载体pET30a为本实验室保存。
[0022]（2）脂肪酶MRL的基因合成、PCR扩增与重组质粒构建本实施例根据已公开的偏甘油酯脂肪酶SMG1的氨基酸序列（Genbank ID: EDP44990.1）在NCBI数据库中进行Blast比对分析，获得与其序列同源性极高的海洋细菌Malassezia restricta脂肪酶MRL的基因序列（SEQ ID NO.1）进行基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成高纯度甘油二酯的酶的制备方法，其特征在于，步骤如下：S1：通过合成海洋细菌Malassezia restricta脂肪酶MRL的基因；S2：重组质粒的构建：以S1中获得的Malassezia restricta脂肪酶MRL的基因序列为模板，利用上游引物F和下游引物R扩增脂肪酶MRL基因，经双酶切后与质粒pET30a连接，获得重组质粒pET30a
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MRL；S3：脂肪酶MRL蛋白表达菌株的构建：将重组质粒pET30a
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MRL导入大肠杆菌BL21中，筛选获得阳性转化子，即为脂肪酶MRL蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：昝新艺，陈志蔚，陈宇星，崔凤杰，叶萍萍，霍书豪，何文森，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：