一种适用于发根农杆菌介导的毛状根转化中高效的基因编辑启动子P制造技术

本发明专利技术公开了一种植物高效启动子P

【技术实现步骤摘要】
一种适用于发根农杆菌介导的毛状根转化中高效的基因编辑启动子P
AtGCS
及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体是涉及一种来自拟南芥的启动子。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9基因编辑技术广泛应用于动植物突变体的创制和基因的功能研究，而基因编辑效率的高低直接影响研究工作的难易程度和工作效率，影响基因编辑效率的因素包括驱动Cas9和sgRNA表达的启动子、编辑靶点所在基因的位置、编辑受体植物的染色体倍型等。其中研究较多同时也是影响基因编辑效率最大的因素是驱动Cas9基因的启动子，因此选用合适的启动子驱动Cas9的表达在提升基因编辑效率中显得尤为重要。尤其是通过发根农杆菌介导的遗传转化进行基因编辑时，所分析的表型是在产生的转基因毛状根上，大部分的性状只有经编辑的基因产生双突的基因型，才能观察到相应的表型。因此通过发根农杆菌介导的遗传转化进行基因编辑研究基因的功能，基因的编辑效率是关键因素，只有基因编辑效率高、产生的双突类型比例高，才有利于进行基因功能分析。

技术实现思路

[0003]针对上述缺陷，本专利技术从拟南芥中克隆了一个AtGCS基因启动子，拟南芥AtGCS基因（AT4G23100）编码谷氨酸
‑
半胱氨酸连接酶（glutamate
‑
cysteine ligase），是催化谷胱甘肽生物合成的第一步和限速步骤，尤其是植物根尖细胞增殖所必需的。在进行植物毛状根转化中，将该启动子驱动Cas9基因的表达进行基因编辑时的效率比35S启动子驱动Cas9基因编辑载体的效率高。
[0004]本专利技术的方案如下：一种从拟南芥中克隆所得AtGCS基因启动子，最长序列为2411bp，该序列位于拟南芥第4染色体：12109162
‑‑
12106752的位置，所述AtGCS基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。
[0005]所述AtGCS基因启动子在驱动Cas9基因表达方面的应用。
[0006]与现有技术相比，本专利技术所具备的优势为：将本专利技术的启动子驱动Cas9基因的表达，在毛状根转化中获得更高的基因编辑效率，减少了科研工作量，尤其是多基因进行基因编辑更为有效。
附图说明
[0007]图1为不同长度的AtGCS基因启动子驱动GUSPlus载体图谱；图2为大豆毛状根中不同长度AtGCSpro驱动GUSPlus表达，GUS染色结果；图3为用毛状根转化分析AtGCS启动子在其他双子叶毛状根中的活性；图4 为pRedU3d
‑
35Cas9载体；图5为pRdGaCas9载体图谱。
具体实施方式
[0008]下面结合实施例和附图详细说明本专利技术的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。
[0009]实施例一:（1）AtGCS基因启动子功能分析：设计PCR扩增引物进行启动子扩增，共设计5对PCR引物，扩增长度分别为：2411bp，1990bp，1640bp，1200bp和850bp，分别连入植物表达载体pCAMBIA1305的HindⅢ/NcoⅠ位点之间分析启动子的活性，载体图谱见图1。通过发根农杆菌介导的毛状根转化大豆，获得的大豆根进行GUS染色，结果表明这5个不同长度的启动子均能够驱动GUSPlus基因的表达。前4个较长的启动子的驱动活性基本相同（图2，A
‑
F），但是该启动子序列缩短至833bp时，其驱动表达活性减弱（图2，G
‑
I）。同时该启动子可以在大部分的双子叶植物比如甘薯、黄瓜、番茄、棉花等毛状根中高效驱动基因的表达（图3），表明了AtGCS基因启动子在双子叶植物中的通用性。
[0010]（2）AtGCS启动子驱动Cas9编辑载体构建：第一步：将pRed1305载体上的DsRed报告基因（Fan Y, Xu F, Zhou H, Liu X, Yang X, Weng K, Sun X and Lyu S. A fast, simple, high efficient and one
‑
step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes
‑
mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 2020, 141: 207
–
216.）用EcoRⅠ/SacⅡ酶切后，插入到基因编辑载体pGSE401（Fan YL, Zhang XH, Zhong LJ, Wang XY, Jin LS, Lyu SH. One
‑
step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes
‑
mediated transformation. BMC Plant Biol. 2020, 20(1):208.）的EcoRⅠ/SacⅡ酶切位点，替换了GUSplus报告基因。用启动子AtU3d （Ma X, Zhang Q, Zhu Q, Liu W, Chen Y, Qiu R, Wang B, Yang Z, Li H, Lin Y, Xie Y, Shen R, Chen S, Wang Z, Chen Y, Guo J, Chen L, Zhao X, Dong Z, Liu YG. A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient, High
‑
Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants. Mol Plant. 2015, 8(8):1274
‑
84.）替换了AtU6
‑
26p，载体命名为pRedU3d
‑
35Cas9载体（图4）。
[0011]第二步：在pRedU3d
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35Cas9的KpnI/XbaI位点分别插入AtGCS启动子（以拟南芥基因组DNA为模板，以引物GaB1(5
’‑
acGGTCTCAGTACATGTGTAGTTGGGCTTCGGT, 添加BsaI酶切位点)和GaX2(5
’‑
GCGTCTAGAGGTATATATAGCTCCTGCAATT, 添加XbaI酶切位点)为组合进行PCR扩增，扩增产物用BsaI/XbaI酶切，构建了AtGCS基因启动子驱动Cas9的载体pRdGaCas9（图5）；（3）选择对大豆超结瘤基因Rj7进行编辑，比较2个载体pRedU3d
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35Cas9和pRdGa1Cas9的编辑效率本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从拟南芥中克隆所得AtGCS基因启动子，其特征在于，所述AtGCS基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.如权利要求1所述的AtGCS基因启动子在...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕山花，樊颖伦，刘爽，王秀媛，
申请(专利权)人：聊城大学，
类型：发明
国别省市：