以沙棘果渣为载体的固氮菌肥制造技术

本发明专利技术公开了一种以沙棘果渣为载体的固氮菌肥，包括制备Sediminibacillus sp.T

【技术实现步骤摘要】
以沙棘果渣为载体的固氮菌肥


[0001]本专利技术涉及一种以沙棘果渣为载体，接种Sediminibacillus sp.T
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28菌株的新型固氮菌肥的研制。

技术介绍

[0002]氮素是水稻等作物生长所必需的大量营养元素之一。作物主要从土壤中获取所需要的氮素。土壤供氮不足会严重危害作物的产量和质量。最初，人们考虑使用氮肥等化学肥料解决这一问题。据统计，全球粮食生产所需氮素约有一半来自化肥供应。然而，近年来，不少相关领域的专家指出，中国氮肥行业已经从原本供不应求步入供过于求的“产能过剩”困境。传统氮肥利用率低下最直接的原因是肥料中释放的养分在土壤中留存的速率和作物需求速率不匹配所造成的养分流失。固氮菌肥占有全球范围内75％的生物肥料市场份额。固氮菌肥能有效提高肥料的利用率，具备兼顾提高作物产量和减轻氮素流失所造成的污染的潜力。然而，新型固氮菌肥的研发受制于具有特异性功能的优势菌株、为菌株提供能源的载体以及适宜的生长环境。因此，固氮菌肥的研制在我国仍有较大发展空间。
[0003]专利技术人所在的课题组近年来从水稻根际发现了一株非共生新型固氮菌——Sediminibacillus sp.T
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28。它具备为水稻提供氮源的能力，可作为固氮菌肥的菌株。为Sediminibacillus sp.T
‑
28菌株选择合适的载体是固氮菌肥首先要完成的工作。我国的沙棘资源非常丰富。沙棘果实中富含多种维生素、氨基酸和黄酮类物质。沙棘果经榨汁后，可得到的副产物——沙棘果渣。它依然保留了沙棘果实富含营养物质的特性。不过，由于沙棘果渣被用于开发其他诸如化妆品、食品的利用率较低，其缺乏良好的资源化利用途径。沙棘资源实际上存在很大的再利用空间。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是提供一种以沙棘果渣为载体的新型固氮菌肥研制方法，本专利技术具有成本低廉、操作简便、促进土壤氮循环，改善土壤微生物群落结构的优势。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种以沙棘果渣为载体的固氮菌肥，包括步骤1)的制备Sediminibacillus sp.T
‑
28菌体，还包括以下步骤：
[0006]2)、利用沙棘果渣制备菌肥载体(与珍珠岩搭配，制备沙棘果渣载体)：
[0007]沙棘果渣经杀青、干燥、粉碎(过0.2mm筛)，所得的沙棘果渣末与珍珠岩按照1～2:1的质量比例混合，然后灭菌(121℃下灭菌20～30min)，得菌肥载体；
[0008]3)、制备T
‑
28的菌悬液：
[0009]将Sediminibacillus sp.T
‑
28菌体先用pH8.0的TE缓冲液洗涤，而后按照菌体：pH8.0的TE缓冲液＝1g:1.8～2.2ml的用量比，在洗涤后Sediminibacillus sp.T
‑
28菌体中加入pH8.0的TE缓冲液均匀混合后形成菌悬液；
[0010]4)、制备固氮菌肥：
[0011]将步骤2)所得的菌肥载体与步骤3)所得的菌悬液按1g:2.8～3.2ml的比例混匀，
于30
±
1℃培养3.5～4.5天，得固氮菌肥。
[0012]作为本专利技术的以沙棘果渣为载体的固氮菌肥的改进，所述步骤1)为：
[0013]将Sediminibacillus sp.T
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28菌株接种在LB液体培养基中，置于28
±
1℃的摇床中，以160
±
30r/min的摇速培养，当发酵菌液中的细胞数目≥10
×
108个/mL时，结束培养(培养时间约为7天)；所得发酵菌液离心后弃上清液，得Sediminibacillus sp.T
‑
28菌体(简称T28菌体)。
[0014]作为本专利技术的以沙棘果渣为载体的固氮菌肥的进一步改进，步骤2)为：
[0015]将沙棘果渣(新鲜的沙棘果渣)先于110
±
10℃杀青15～20min，然后于55～65℃烘干22～26h，烘干后的沙棘果渣粉碎至过0.2mm筛，得沙棘果渣末。
[0016]作为本专利技术的以沙棘果渣为载体的固氮菌肥的进一步改进，步骤3)为：在洗涤后Sediminibacillus sp.T
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28菌体中加入pH8.0的TE缓冲液于150
±
30rpm的震荡频率下均匀振荡20～40min，得菌悬液。
[0017]作为本专利技术的以沙棘果渣为载体的固氮菌肥的进一步改进，步骤4)为：将步骤2)所得的菌肥载体与步骤3)所得的菌悬液混合后，先于100
±
30r/min转速震荡2
±
0.2h从而实现混匀，而后30℃恒温培养4天，得固氮菌肥。
[0018]作为本专利技术的以沙棘果渣为载体的固氮菌肥的进一步改进，步骤2)中，沙棘果渣末：珍珠岩＝1:1或2:1的质量比。
[0019]本专利技术所用的菌株为从水稻根际提取得到的Sediminibacillus sp.T
‑
28菌株，该菌株在《新型固氮菌肥对土壤氮转化微生物群落结构的研究》、《促进植物生长新型固氮菌株的筛选》中有明确告知。其菌落形态为圆形、淡黄色、边缘较为整齐、表面光滑、湿润凸起，如图1所示。根据先前的研究结果，Sediminibacillus sp.T
‑
28菌株为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，无运动性，杆状，宽1.3
‑
1.5μm，长2.8
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3.2μm，其具有中央椭圆内生孢子。高通量测序所得的T28的16S rDNA部分序列在NCBI上进行BLAST比较，T28在系统发育地位上属于Bacteria，Firmicutes，Bacilli，Bacillales，Bacillaceae，Bacillus。
[0020]本专利技术是一种新型固氮菌肥研制方法：应用T28菌与沙棘果渣载体进行联合改善土壤微生物群落结构。本专利技术运用荧光定量PCR(q
‑
PCR)和
13
C
‑
PLFA两项微生物分析技术表征土壤微生物群落结构。
[0021]本专利技术对固氮菌T28进行特制的沙棘果渣载体接种，制成的菌株
‑
沙棘果渣载体复合体作为固氮菌肥施入稻田土壤，从而改善土壤微生物群落结构。本专利技术的固氮菌肥研制方法是通过向稻田土壤中施入新型固氮螺菌T28与沙棘果渣载体结合而成的固氮菌肥，从而提高土壤中氮循环功能基因的丰度，并改善微生物群落结构。方法简便、成本低廉，因此具有广阔的应用前景。
[0022]本专利技术具有如下技术优势：
[0023]首次提出以营养丰富的沙棘果渣为物料，通过非共生固氮功能菌株接种方法制成生态肥料，用于调控土壤养分。结合“果蔬废弃物资源化有效利用、作物增产增效、保护环境、节能减排”的方向，将面源污染生态环境问题和实现食品工本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.以沙棘果渣为载体的固氮菌肥，包括步骤1)的制备Sediminibacillus sp.T
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28菌体，其特征在于还包括以下步骤：2)、利用沙棘果渣制备菌肥载体；3)、制备T
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28的菌悬液；4)、制备固氮菌肥。2.根据权利要求1所述的以沙棘果渣为载体的固氮菌肥，其特征在于：2)、利用沙棘果渣制备菌肥载体：沙棘果渣经杀青、干燥、粉碎，所得的沙棘果渣末与珍珠岩按照1～2:1的质量比例混合，然后灭菌，得菌肥载体；3)、制备T
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28的菌悬液：将Sediminibacillus sp.T
‑
28菌体先用pH8.0的TE缓冲液洗涤，而后按照菌体：pH8.0的TE缓冲液＝1g:1.8～2.2ml的用量比，在洗涤后Sediminibacillus sp.T
‑
28菌体中加入pH8.0的TE缓冲液均匀混合后形成菌悬液；4)、制备固氮菌肥：将步骤2)所得的菌肥载体与步骤3)所得的菌悬液按1g:2.8～3.2ml的比例混匀，于30
±
1℃培养3.5～4.5天，得固氮菌肥。3.根据权利要求2所述的以沙棘果渣为载体的固氮菌肥，其特征在于所述步骤1)为：将Sediminibacillus sp.T
‑
28菌株接种在LB液体培养基中，置于28
±
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【专利技术属性】
技术研发人员：张奇春，杨小渔，吴丹，徐丹亭，叶放，万清，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：