多重PCR引物设计方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及一种多重PCR引物设计方法和装置，方法包括：获取肿瘤样本的变异信息，根据所述变异信息选取预设数量的监测位点以构成监测位点集合；根据每个监测位点在参考基因组上对应的目标序列设计至少一个候选引物对，对于每个监测位点选取一个候选引物对以生成监测位点集合对应的评估引物对集合；对评估引物对集合来自于不同候选引物对的两两引物进行引物二聚体评估，根据评估引物对集合中所有引物的引物二聚体评估结果筛选合格的候选引物对作为目标多重PCR引物。本发明专利技术的多重PCR引物设计方法，能够针对性地对肿瘤患者的突变位点设计多重PCR引物，实现稳定检出丰度≥0.02％的ctDNA突变信息的目的。ctDNA突变信息的目的。ctDNA突变信息的目的。

【技术实现步骤摘要】
多重PCR引物设计方法和装置


[0001]本专利技术涉及生物信息学
，具体而言，涉及一种多重PCR引物设计方法和装置。

技术介绍

[0002]微小残留病灶（Minimal Residual Disease，MRD）是指在患者接受治疗期间或之后，其体内仍有少量肿瘤细胞或者微小病灶的临床状态，也叫分子残留病变（Molecular Residual Disease）或可测量残留病灶（Measurable Residual Disease）。
[0003]MRD适用于实体肿瘤和血液系统肿瘤，更常用于表示血液系统肿瘤患者骨髓中持续存在的低于标准检出限的恶性细胞。在肿瘤治疗后，体内残留的肿瘤细胞会继续增殖，导致疾病复发。治疗后出现MRD的原因可能是因为并非所有癌细胞都对治疗有反应，也可能因为肿瘤细胞对所使用的药物产生了耐药，MRD的存在可能预示着治疗不完全有效或治疗不完全。
[0004]因此，临床MRD的检测可以用于评估治疗效果、警示复发风险和判断疾病预后等，意义重大。但因为微小残留病灶极小或残留肿瘤细胞量极少，通过传统影像学或其它实验方法已经很难检测到，因而需要更加灵敏的检测技术。
[0005]循环肿瘤基因（循环肿瘤DNA），即ctDNA（ circulating tumor DNA），是指肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，通过ctDNA检测，能够检出血液中的肿瘤踪迹，是MRD检测常用的标志物。
[0006]目前采用ctDNA作为标志物检测MRD主要采用肿瘤先验分析（Tumor
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informed assays）和肿瘤未知分析（Tumor
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agnostic assays）两种策略。肿瘤先验分析策略是利用固定大panel测序或者全外显子（WES）测序先获取每个患者的变异信息，为患者订制相应的精准测序panel，以通过对ctDNA的超深度测序进行复发监控。
[0007]肿瘤未知分析策略通常以驱动基因和靶向药物基因设计一组引物，结合如甲基化等的多组学方法进行检测，直接利用固定的panel介入监测流程开展检测，旨在检测已知基因组变异（ctDNA突变）和表观遗传学特征（ctDNA甲基化）。相比较而言，肿瘤未知分析策略虽然设计覆盖的位点更多，但是针对每位患者的有效监控位点数量不及肿瘤先验分析策略。
[0008]肿瘤先验分析策略利用ctDNA检测MRD具体包括：通过生物信息算法得到肿瘤样本准确的体细胞突变信息，肿瘤细胞微环境中存在肿瘤细胞的克隆进化，根据突变结果使用pyclone对体细胞变异做克隆聚类，得到样本的主亚克隆聚类，再根据聚类结果挑选主克隆位点进行后续多重PCR引物设计监测主克隆位点的变化。
[0009]一般多重PCR设计使用的扩增子大小在300bp左右，但是ctDNA的片段大小为90
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150bp，为有效检测到MRD，引物设计时包含引物序列在内片段大小只能为100bp左右及以内。primer3是现在最广泛被使用的PCR引物设计软件，通常primer3只能检测一对引物之间的发夹结构，TM值等，并不能检查多重PCR引物间的引物二聚体和非特异性扩增情况，而引
物二聚体和非特异性扩增是影响多重PCR能否成功和检测LOD（limit of detection）关键。
[0010]因此，如何减少引物二聚体和非特异性扩增是设计检测ctDNA多重PCR引物的难点。

技术实现思路

[0011]为了解决上述问题，减少引物二聚体和非特异性扩增，本专利技术的第一目的在于提供一种多重PCR引物设计方法，包括：获取肿瘤样本的变异信息，根据变异信息确定肿瘤样本的主克隆位点集合、亚克隆位点集合以及每个位点的细胞流行率，根据位点的细胞流行率在主克隆位点集合和亚克隆位点集合取预设数量的监测位点以构成监测位点集合；根据每个监测位点在参考基因组上对应的目标序列设计至少一个候选引物对，对于每个监测位点选取一个候选引物对以生成监测位点集合对应的评估引物对集合，目标序列的长度为90
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150bp；获取评估引物对集合中来自于不同候选引物对的两条引物形成的重叠序列，根据重叠序列中每对碱基的配对类型确定两条引物的配对分值；根据配对分值判断配对分值对应的两条引物是否满足保留条件；若评估引物对集合中所有自于不同候选引物对的两条引物均满足保留条件，则选取评估引物对集合中的所有候选引物对作为目标多重PCR引物；若配对分值对应的两条引物不满足保留条件，丢弃两条引物中的任意一条引物对应的监测位点，根据细胞流行率选择新的监测位点加入监测位点集合，并将新的监测位点的一个候选引物对加入评估引物对集合，重新对评估引物对集合中所有来自于不同候选引物对的引物进行引物二聚体评估。
[0012]本专利技术的一种实现方式中，变异信息包括每个变异位点的参考序列reads数、突变序列reads数和每个变异位点所在基因的拷贝数变异信息。
[0013]本专利技术的一种实现方式中，根据位点的细胞流行率在主克隆位点集合和亚克隆位点集合取预设数量的监测位点以构成监测位点集合具体包括：判断主克隆位点集合中主克隆位点的数量是否小于预设数量；若主克隆位点的数量不小于预设数量，按照细胞流行率从高到低在主克隆位点集合中选取预设数量主克隆位点以构成监测位点集合；若主克隆位点的数量小于预设数量，将主克隆位点集合中所有主克隆位点作为监测位点，按照细胞流行率从高到低在亚克隆位点集合中选取剩余数量的监测位点，以获得预设数量的监测位点以构成监测位点集合。
[0014]本专利技术的一种实现方式中，根据位点的细胞流行率在主克隆位点集合和亚克隆位点集合取预设数量的监测位点以构成监测位点集合之后包括：判断变异位点是否包括预设突变；若变异位点存在预设突变，判断预设数量的监测位点是否包含预设突变；若预设数量的监测位点不包含预设突变，则将预设突变作为监测位点加入监测位点集合。
[0015]本专利技术的一种实现方式中，根据每个监测位点在参考基因组上对应的目标序列设
计至少一个候选引物对，对于每个监测位点选取一个候选引物对以生成监测位点集合对应的评估引物对集合具体包括：对于每个监测位点，在参考基因组上以每个监测位点为中心截取150bp的序列作为目标序列；将每个监测位点对应的目标序列作为模板设计每个监测位点的至少一个候选引物对，对于每个监测位点选取一个候选引物对以获得监测位点集合对应的评估引物对集合。
[0016]本专利技术的一种实现方式中，获取评估引物对集合中来自于不同候选引物对的两条引物的重叠序列，根据重叠序列中每对碱基的配对类型确定两条引物的配对分值具体包括：将评估引物对集合中来自于不同候选引物对的两条引物头尾相对滑动以获取两条引物每次滑动形成的重叠序列；根据每次滑动形成的重叠序列每对碱基的配对类型确定两条引物每次滑动的配对分值，配对类型包括错配型和互补配对型，配对分值等于互补配对型碱基对数量和错配型碱基对数量的差值；将两条引物相对滑动形成的重叠序列的最高配对分值作为两条引物的配本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重PCR引物设计方法，其特征在于，包括：获取肿瘤样本的变异信息，根据所述变异信息确定肿瘤样本的主克隆位点集合、亚克隆位点集合以及每个位点的细胞流行率，根据位点的细胞流行率在所述主克隆位点集合和亚克隆位点集合选取预设数量的监测位点以构成监测位点集合；根据每个监测位点在参考基因组上对应的目标序列设计至少一个候选引物对，对于每个监测位点选取一个候选引物对以生成监测位点集合对应的评估引物对集合，所述目标序列的长度为90
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150bp；获取评估引物对集合中来自于不同候选引物对的两条引物形成的重叠序列，根据重叠序列中每对碱基的配对类型确定两条引物的配对分值；根据所述配对分值判断所述配对分值对应的两条引物是否满足保留条件；若评估引物对集合中所有来自不同候选引物对的两条引物均满足保留条件时，则选取评估引物对集合中的所有候选引物对作为目标多重PCR引物；若所述配对分值对应的两条引物不满足保留条件，丢弃两条引物中的任意一条引物对应的监测位点，根据位点的细胞流行率在所述主克隆位点集合和亚克隆位点集合选择新的监测位点加入监测位点集合，并将新的监测位点的一个候选引物对加入评估引物对集合，重新对评估引物对集合中所有来自于不同候选引物对的引物进行引物二聚体评估。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述变异信息包括每个变异位点的参考序列reads数、突变序列reads数和每个变异位点所在基因的拷贝数变异信息。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述根据位点的细胞流行率在所述主克隆位点集合和亚克隆位点集合选取预设数量的监测位点以构成监测位点集合具体包括：判断主克隆位点集合中主克隆位点的数量是否小于预设数量；若主克隆位点的数量不小于预设数量，按照所述细胞流行率从高到低在主克隆位点集合中选取预设数量主克隆位点以构成监测位点集合；若主克隆位点的数量小于预设数量，将主克隆位点集合中所有主克隆位点作为监测位点，按照细胞流行率从高到低在亚克隆位点集合中选取剩余数量的监测位点，以获得预设数量的监测位点以构成监测位点集合。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述根据位点的细胞流行率在所述主克隆位点集合和亚克隆位点集合选取预设数量的监测位点以构成监测位点集合之后包括：判断所述变异位点是否包括预设突变；若所述变异位点存在预设突变，判断所述预设数量的监测位点是否包含所述预设突变；若预设数量的监测位点不包含所述预设突变，则将所述预设突变作为监测位点加入监测位点集合。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据每个监测位点在参考基因组上对应的目标序列设计至少一个候选引物对，对于每个监测位点选取一个候选引物对以生成监测位点集合对应的评估引物对集合具体包括：对于每个监测位点，在参考基因组上以每个监测位点为中心截取150bp的序列作为目标序列；将每个监测位点对应的目标序列作为模板设计每个监测位点的至少一个候选引物对；
对于每个监测位点选取一个候选引物对以获得监测位点集合对应的评估引物对集合。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述获取评估引物对集合中来自于不同候选引物对的两条引物的重叠序列，根据重叠序列中每对碱基的配对类型确定两条引物的配对分值具体包括：将评估引物对集合中来自于不同候选引物对的两条引物相对滑动以获取两条引物每次滑动形成的重叠序列；根据每次滑动形成的重叠序列每对碱基的配对类型确定两条引物每次滑动的配对分值，所述配对类型包括错配型和互补配对型，所述配对分值等于互补配对型碱基对数量和错配型碱基对数量的差值；将两条引物相对滑动形成的重叠序列的最高配对分值作为两条引物的配对分值。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述根据所述配对分值判断所述配对分值对应的两条引物是否满足保留条件具体包括：比较所述配对分值和预设阈值的大小；若比较结果为所述配对分值小于预设阈值，则判断所述配对分值对应的两条引物满足保留条件；若比较结果为所述配对分值不小于预设阈值，则判断所述配对分值对应的两条引物不满足保留条件。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述判断所述配对分值是否小于预设阈值具体包括；判断所述两条引物的配对分值对应的重叠序列每对碱基的配对类型是否包括错配型；若...

【专利技术属性】
技术研发人员：王维锋，郑新，姚继成，
申请(专利权)人：上海至本医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：