一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法及应用，本发明专利技术公开了一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法，包括以下步骤：利用CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑，使Solyc02g084630基因功能丧失，得到番茄雄性不育材料，所述Solyc02g084630基因的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术得到的番茄雄性不育材料育性稳定，可以创制不同遗传背景的雄性不育系，从而可以应用于杂交育种和制种。从而可以应用于杂交育种和制种。从而可以应用于杂交育种和制种。

【技术实现步骤摘要】
一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法及应用。

技术介绍

[0002]番茄(Solanum lycopersicum)是全球最重要的园艺经济作物之一，也是我国最主要的消费蔬菜。番茄属于严格的闭花授粉作物，具有明显的杂种优势，对其利用能极大提高番茄的产量、抗病及抗逆表现，是重要的育种手段。目前番茄杂交种生产仍然以费时、费力、制种成本高、种子纯度无保障的人工去雄授粉法为主，在制种时引入雄性不育系可以优化制种程序，降低劳动力成本，提高杂种种子纯度以及避免亲本流失。因此开发更便于生产应用的雄性不育系是番茄杂交育种研究的重点。
[0003]植物中许多重要的转录因子家族成员参与调控雄蕊及花药的发育，突变后往往会造成植物雄性不育，比如拟南芥(Arabidopsis thaliana)DYT1(DYS
‑
FUNCTIONAL TAPETUM1)基因及其在水稻中的直系同源基因UDT1(Undeveloped Tapetum1)均属于bHLH转录因子家族，调控绒毡层的早期发育，突变将导致绒毡层发育不正常从而引起雄性不育(Fuet al.,2014)。拟南芥中APELATA3(AP3)是花发育B类功能基因，是MADS
‑
box基因家族成员，该基因发生突变将导致花器官发生同源异型突变，原本的花瓣转变成萼片状器官，同时原本的雄蕊也转变成雌蕊状结构，即雄性不育。番茄雄性不育系通常是将突变体材料中的不育基因经反复回交转育到所需要的亲本材料中形成新的不育系，由于不育基因常与部分不良基因连锁，用传统的回交转育方法培育优良的不育系耗时费力，极大地限制了番茄品种的更新迭代速率。
[0004]基因组编辑技术是一种可在基因组水平上对DNA序列进行改造的分子生物学技术，其原理是利用核酸内切酶切断目的DNA序列，通过DNA修复过程中产生的一系列突变达到定向改造基因组的目的。其中，CRISPR
‑
Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR
‑
CRISPR associated protein)系统是一类来源于细菌适应性免疫防御系统的核酸酶，属于第三代基因编辑工具。该系统仅需要一个包含DNA结合及切割功能的核酸酶蛋白和一条用来指导核酸酶蛋白与DNA结合的向导RNA即可实现对核心亲本目标性状的快速、精准改良，且避免了杂交育种中的连锁累赘，在作物定向育种中具有巨大的应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法及应用。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007]一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法，包括以下步骤：
[0008]利用CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑，使Solyc02g084630基因
功能丧失，得到番茄雄性不育材料，所述Solyc02g084630基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]进一步的，所述CRISPR/Cas9技术中的gRNA靶位点选择在Solyc02g084630基因的第一外显子区域，选取原型间隔序列毗邻基序(protospacer
‑
associated motif，PAM)上游19
‑
20bp碱基长度，即5'
‑
N19
‑
20NGG
‑
3'，NGG为PAM序列，N19
‑
20代表19
‑
20bp碱基的识别序列，所述Solyc02g084630基因的第一外显子区域的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]进一步的，所述gRNA靶位点的序列包括Target1和/或Target2，所述Target1、Target2序列如下：
[0011]Target1:5
’‑
TGAAAACTCGACAAACAGGC
‑3’
；
[0012]Target2:5
’‑
TCATCATGCTATCAAGCACC
‑3’
。为保证编辑效率，可以选择两个靶位点。
[0013]进一步的，利用CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑使Solyc02g084630基因功能丧失的方法为：利用CRISPR/Cas9技术使Solyc02g084630基因形成DNA双链断裂位点(double
‑
strand breaks,DBSs)，利用植物自身对DBS的修复机制，在断裂位点引入插入、缺失或替换，导致Solyc02g084630基因的功能丧失。
[0014]进一步的，所述CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑的方法步骤包括：
[0015]S1、根据识别序列设计oligo序列引物，所述引物包括Target1
‑
F和/或Target2
‑
F，
[0016]所述Target1
‑
F为5
’‑
atatatggtctcgattg N19
‑
20 gttttagagctagaaatag
‑3’
，
[0017]所述Target2
‑
F为5
’‑
attattggtctcgaaac N19
‑
20caatctcttagtcgactct
‑3’
，其中，N19
‑
20代表19
‑
20bp碱基的识别序列；
[0018]S2、以中间载体pCBC
‑
DT1T2为模板，加入所述oligo序列引物，用高保真酶进行PCR扩增，回收PCR产物；
[0019]S3、将pKSE401载体及所述PCR产物用BsaI内切酶进行酶切，酶切产物回收后，按照载体：片段＝1:7(摩尔比)进行混合，通过T4 DNA连接酶进行连接反应；
[0020]S4、将连接后的载体转入大肠杆菌感受态，挑取单克隆进行菌体PCR，菌体PCR所用引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；
[0021]S5、将菌体PCR结果鉴定为阳性的质粒进行测序分析，测序所用引物序列如SEQ ID NO.3所示，将测序正确的质粒，转入农杆菌GV3101感受态，并进行菌体PCR，得到包含正确质粒的阳性农杆菌；
[0022]S6、以番茄子叶为外植体，通过叶盘转化法进行阳性农杆菌GV3101介导的遗传转化，经过卡那霉素抗性筛选，获得再生植株。
[0023]进一步的，所述CRISPR/Cas本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑，使Solyc02g084630基因功能丧失，得到番茄雄性不育材料，所述Solyc02g084630基因的序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9技术中的gRNA靶位点选择在Solyc02g084630基因的第一外显子区域，选取原型间隔序列毗邻基序上游19
‑
20bp碱基长度，所述Solyc02g084630基因的第一外显子区域的序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述gRNA靶位点的序列包括Target1和/或Target2，所述Target1、Target2序列如下：Target1:5
’‑
TGAAAACTCGACAAACAGGC
‑3’
；Target2:5
’‑
TCATCATGCTATCAAGCACC
‑3’
。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑使Solyc02g084630基因功能丧失的方法为：利用CRISPR/Cas9技术使Solyc02g084630基因形成DNA双链断裂位点，利用植物自身对DBS的修复机制，在断裂位点引入插入、缺失或替换，导致Solyc02g084630基因的功能丧失。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9技术对Solyc02g084630基因进行编辑的方法步骤包括：S1、根据识别序列设计oligo序列引物，所述引物包括Target1
‑
F和/或Target2
‑
F，所述Target1
‑
F为5
’‑
atatatggtctcgattg N19
‑
20 gttttagagctagaaatag
‑3’
，所述Target2
‑
F为5
’‑
attattggtctcgaaac N19

【专利技术属性】
技术研发人员：杨亮，刘欢，李菊，李志，龙海成，苗明军，常伟，
申请(专利权)人：四川省农业科学院园艺研究所，
类型：发明
国别省市：