CsMLO基因在提高黄瓜花瓣数和心室数中的应用制造技术

本发明专利技术涉及CsMLO基因在提高黄瓜花瓣数和心室数中的应用。目的是提供一种通过CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑黄瓜花瓣数和心室数CsMLO基因，通过农杆菌介导的遗传转化的方法获得转基因植株的方法。随后通过连续两代自交，分离获得不含Cas9的mlo多突变体，对T2代突变体调查表型，发现CsMLO基因可以影响黄瓜花瓣数目以及心室数。CsMLO多突变体中花瓣数目增加，果实心室数目增多。果实心室数目增多。果实心室数目增多。

【技术实现步骤摘要】
因黄瓜中花瓣数目增加，果实心室数目增多，能够提高黄瓜产量。
[0007]本专利技术为解决现有技术中的技术问题，所采用的技术方案具体如下：
[0008]一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对黄 瓜的CsMLO基因进行编辑，使得黄瓜的花瓣数和心室数增多。
[0009]进一步，编辑的CsMLO基因具体为CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、 CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10，其对应的DNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8 所示。
[0010]进一步，编辑的CsMLO基因具体为CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、 CsMLO10，其对应的DNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
[0011]进一步，对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、 CsMLO10进行编辑的方式为：通过将CsMLO2自5
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末端第1
–
1755位碱基、CsMLO3自5
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1431位碱基、CsMLO4自5r/>′
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1710位碱基、CsMLO5自5
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1617 位碱基、CsMLO6自5
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1671位碱基、CsMLO7自5
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1707位碱基、CsMLO9 自5
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末端第1
–
1626位碱基、CsMLO10自5
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末端第1
–
1551位碱基所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
[0012]进一步，对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10进行编 辑的方式为：通过将CsMLO2自5
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1755位碱基、CsMLO3自5
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1551位碱基所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
[0013]进一步，对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10进行编 辑的方式为：将CsMLO2的第535
‑
558位碱基缺失，在CsMLO3的538位后插入22个碱 基，将CsMLO4的第401
‑
419位碱基缺失，将CsMLO5的第512位碱基缺失，将CsMLO9 的第337位碱基插入一个碱基，将CsMLO10的第516位碱基缺失。
[0014]进一步，对黄瓜的CsMLO基因编辑的具体方法如下：
[0015]针对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10 基因的外显子区域设计sgRNA；
[0016]将CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10 基因的sgRNA合成为一个表达元件组，并将该表达元件组插入到pBCG403载体中，到八 靶载体；
[0017]将八靶载体转化到农杆菌EHA105中；
[0018]利用转化有八靶载体的农杆菌EHA105侵染CU2黄瓜种子，得到转基因黄瓜植株T0 代；
[0019]转基因黄瓜植株T0代自交得到T1代，T1代自交留种分离获得不含Cas9非转基因多 突变体，即得到高产量黄瓜品种。
[0020]进一步，八个sgRNA靶点的核苷酸序列分别为：
[0021]CsMLO2：CTCTACAGTGTTCTCACCA
[0022]CsMLO3：TTTGCAGAGGCTAGAAGCA
[0023]CsMLO4：TGGCTAATTCGAAGATCAT
[0024]CsMLO5：CCCTGGCTATGATTAAGGT
[0025]CsMLO6：GTGCTCTTCCGCATCAATG
[0026]CsMLO7：TATTCAACGGTGAGCTCTA
[0027]CsMLO9：TGACAATTCATCCGAGGAA
[0028]CsMLO10：TGTCACGTGGACGATAGCT。
[0029]进一步，表达元件组的序列如SEQ ID NO.9所示。
[0030]检测CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10 编辑情况的PCR引物如下：
[0031][0032][0033]一种提高黄瓜产量的方法，其特征在于，种植上述方法培育的黄瓜品种。
[0034]一种重组质粒载体，其特征在于，将序列如SEQ ID NO.9所示的表达元件组，插入到 pBCG403质粒得到。
[0035]本专利技术还涉及CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10在调 控黄瓜花瓣数和心室数中的应用。
[0036]有益效果
[0037]本专利技术构建了CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、 CsMLO10基因的CRISPR/Cas9表达载体，并将其通过农杆菌介导的遗传转化导入CU2黄 瓜种质中。为
了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，在所用植物表达载体中加 入了表达绿色荧光蛋白的GFP基因、草甘膦抗性标记等。经过稳定遗传转化后成功地获得 了转基因T0代，T0自交得到T1代，T1代自交留种分离获得不含Cas9非转基因多突变体， 对T2代多突变体进行表型统计调查，发现CsMLO基因可以影响黄瓜花瓣发育和心室发育。 Csmlos突变体中花瓣的数目增加，果实的心室数目增多。
[0038]本专利技术在设计实验方案前，预测的是CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsML本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对黄瓜的CsMLO基因进行编辑，使得黄瓜的花瓣数和心室数增多。2.根据权利要求1所述的一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，编辑的CsMLO基因具体为CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10，其对应的DNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。3.根据权利要求1所述的一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10进行编辑的方式为：通过将CsMLO2自5
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1551位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。4.根据权利要求1所述的一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，对黄瓜的CsMLO基因编辑的具体方法如下：针对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10基因的外显子区域设计sgRNA；将CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10基因的sgRNA合成为一个表达元件组，并将该表达元件组插入到pBCG403载体中，到八靶载体；将八靶载体转化到农杆菌EHA105中；利用转化有八靶载体的农杆菌EHA105侵染CU2黄瓜种子，得到转基因黄瓜植株T0代；转基因黄瓜植株T0代自交得到T1代，T1代自交留种分离获得不含Cas9非转基因多突变体，即得到高产量黄瓜品种。5.根据权利要求4所述的一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，八个sgRNA靶点的核苷酸序列分别为：CsMLO2：CTCTACAGTGTTCTCACCACsMLO3：TTTGCAGAGGCTAGAAGCACsMLO4：TGGCTAATTCGAAGATCATCsMLO5：CCCTGGCTATGATTAAGGTCsMLO6：GTGCTCTTCCGCATCAATGCsMLO7：TATTCAACGGTGAGCTCTACsMLO9：TGACAATTCATCCGAGGAACsMLO10：TGTCACGTGGACGATAGCT。6.根据权利要求4所述的一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，表达元件...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽，马明茹，赵欣，张敏，何秋雨，别之龙，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：