一种CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了sgRNA、所述的表达盒、重组载体或细胞，本发明专利技术还公开了sgRNA、所述的表达盒、重组载体或细胞、所述的引物对在CD163基因编辑中的应用。本发明专利技术还公开了一种打靶载体及其制备方法和应用。本发明专利技术最后还公开了一种CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法以及鉴定CD163基因猪源化小鼠的方法。本发明专利技术通过CRISRP/Cas9基因修饰的方法，将猪的CD163基因替换了小鼠的Cd163基因，制备了CD163猪源化小鼠模型，具有猪的功能性基因，对于猪源相关病毒的感染、入侵以及免疫等研究有十分重要的意义，将可能成为筛选评价非洲猪瘟、蓝耳病等相关的药物及诊断产品的理想动物模型，为控制疫情的发展带来新的思路和策略。情的发展带来新的思路和策略。情的发展带来新的思路和策略。

【技术实现步骤摘要】
一种CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法。

技术介绍

[0002]近年来蔓延的非洲猪瘟疫情给我国生猪产业带来了严重的打击，是目前我国养猪业的“头号杀手”。非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种猪烈性传染病，该病对全球养猪业带来了极大的困难和挑战。强毒株引发的超急性和急性感染致死率几乎高达100％。2018年8月，ASF传入中国，目前在国内32个省份均有疫情爆发。
[0003]非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种独特的双链DNA病毒，主要通过从口鼻黏膜进入扁桃体，以受体介导的“细胞内吞”方式进入细胞，复制后通过淋巴液、血液快速扩散至全身。免疫是猪抵抗ASFV的第一道屏障。单核细胞和巨噬细胞是ASFV最主要的感染细胞，并且高度成熟的、细胞表达高水平的特定标记的巨噬细胞最容易感ASFV。
[0004]CD163清道夫受体是猪巨噬细胞和单本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.sgRNA，其特征在于，其具有：(i)、如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或(ii)、如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的互补序列；或(iii)、与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核苷酸序列不同的序列；或(iv)、与(i)或(ii)或(iii)所述序列至少有70％同源性的序列。2.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求1所述的sgRNA。3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组载体为pUC57kan
‑
T7
‑
delG
‑
sgRNA。4.扩增或鉴定权利要求1所述的sgRNA、权利要求2所述的表达盒、重组载体或细胞的引物对。5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述引物对序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；或/和SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。6.权利要求1所述的sgRNA、权利要求2所述的表达盒、重组载体或细胞、权利要求4或5所述的引物对在CD163基因编辑中的应用。7.一种打靶载体，其特征在于，所述打靶载体包括如下元件：上游同源臂、猪源CD163基因、Stop元件和下游同源臂，所述上游同源臂序列如SEQ ID NO：34所示，所述猪源CD163基因序列如SEQ ID NO：35所示，所述Stop元件序列如SEQ ID NO：37所示，所述下游同源臂序列如SEQ ID NO：38所示。8.根据权利要求7所述的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体的序列如SEQ ID NO：39所示。9.权利要求7或8所述的打靶载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将上游同源臂、下游同源臂、合成的pCD163基因片段采用融合PCR的方式进行融合，融合后的产物与stop元件、pMD18T载体进行slic连接即得。10.权利要求7或8所述的打靶载体在制备CD163基因猪源化动物模型中的应用。11.一种CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将权利要求1所述的sgRNA的DNA序列克隆至载体中，构建重组质粒；2)对步骤1)得到的重组质粒为模板进行PCR扩增获得模板，对模板进行转录获得sgRNA；3)将sgRNA与Cas9蛋白孵育，加入权利要求7或8的打靶载体后得到的混合液注射至小鼠受精卵中，移植至假孕雌鼠体内，等小鼠出生后，基因鉴定筛选出的中靶小鼠即阳性小鼠；4)将得到的阳性小鼠与野生型小鼠配繁，出生的小鼠经过基因鉴定，获得稳定遗传的CD163猪源化小鼠动物模型。12.根据权利要求11所述的CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤3)和步骤4)的基因鉴定包括对小鼠鼠尾基因组DNA进行5
’
端和3
’
端的PCR鉴定，若PCR鉴定检测到预期条带，则表明目标片段在靶位点发生了重组，并同时对PCR产物进行测序，测序正确即为阳性小鼠。13.根据权利要求12所述的CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述
5
’<...

【专利技术属性】
技术研发人员：金晶，张瑞瑞，苏会敏，赵静，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：