一种手性止血多肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种手性止血多肽及其制备方法与应用，该手性止血多肽的结构式如式(Ⅰ)所示。其制备方法包括：树脂的活化，氨基酸的耦联，多肽的切除和沉淀，多肽的分离纯化。本发明专利技术制得的手性止血多肽有良好的生物相容性，不会引起伤口部位的炎性反应，具有结合钙离子的功能，且在止血与骨再生等方面表现出优异的效果。果。果。果。

【技术实现步骤摘要】
一种手性止血多肽及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种手性止血多肽及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]牙拔除术后出血是口腔临床工作中最常见的并发症，大多因局部因素引起，如处理不及时可导致严重的并发症。填塞法是最常见的拔牙窝出血处理方式，合理使用局部止血材料充填拔牙窝是治疗及预防拔牙后出血的重要措施。传统拔牙窝止血材料
‑
碘仿纱条是早年常用的止血材料，但因其不可降解，需二次手术取出延迟拔牙窝愈合，已逐渐被淘汰。
[0003]常用的止血材料包括明胶海绵、纤维蛋白胶和医用胶原蛋白。因明胶海绵价格低廉，是临床上常用的拔牙后止血填充材料。但明胶海绵易软化，不适合用于拔牙窝大量出血，易被血液冲出，无法达到止血效果。纤维蛋白胶是从人或哺乳动物血浆制备而来，主要成分是黏蛋白和凝血酶浓缩物，通过高浓度的纤维蛋白原及凝血因子模拟机体凝血过程形成纤维蛋白膜达到止血作用，且可用于凝血功能障碍的患者，但由于其是血液制品存在诱发免疫反应风险。医用胶原蛋白是胶原蛋白制作的胶原塞，通过吸收水分或血液后可膨胀，能粘附于组织表面，达到止血效果。在出血量较大的情况下，胶原塞也不易软化。尽管上述临床上使用的止血材料充填及覆盖拔牙窝后均有一定的止血效果，然而在预防及快速控制失血方面尚存在不足。
[0004]随着研究发现，近年研究人员利用自组装多肽水凝胶在大组织器官损伤止血方面取得一定成效，如肝外伤止血、心脏穿透止血，因其不用缝合且具有良好生物相容性和安全性，作为止血材料具有独特地优势。自组装多肽水凝胶原理是通过多肽在疏水作用、静电作用和氢键结合等非共价弱相互作用的驱动下，自组装多肽可以在出血部位凝胶化，进而显著减少失血。这种由弱相互作用驱动的自我组装成特定的网络纳米结构形成物理屏障，但微弱的闭合体间相互作用使得它们较脆弱。同时，自组装多肽水凝胶能否用于口腔拔牙止血也难以预期。
[0005]现有临床上常用拔牙窝止血材料，如明胶海绵和医用胶原蛋白，大都通过机械压迫方式借助材料吸血膨胀，粘附，凝血，达到止血效果。尽管上述材料都具有一定的止血功效，但是部分止血材料对大量出血或凝血功能障碍无效，且止血材料本身缺少与机体相互作用机制，不能达到快速止血效果。而现有的自组装多肽水凝胶，多肽由于其特殊的分子结构，容易被蛋白酶识别和水解，难以兼顾稳定性与功效性。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于解决现有的明胶海绵、纤维蛋白胶、医用胶原蛋白、自组装多肽水凝胶等止血材料存在的止血速度缓慢、止血效果不佳、功能相对单一、难以兼顾稳定性与功效性等问题。
[0007]基于上述目的，本专利技术提供了以D型氨基酸为原料的一种手性止血多肽来解决本
领域内的这种需要。
[0008]一方面，本专利技术涉及一种手性止血多肽，一种手性止血多肽结构式如式(Ⅰ)所示：
[0009][0010]另一方面，本专利技术涉及一种手性止血多肽的制备方法，其包括：
[0011]树脂的活化：DMF浸泡溶胀树脂30min，去除液体后，采用DMF和DCM交替洗涤2次，然后用DMF洗涤2次，每次洗涤时间为30s。；
[0012]氨基酸的耦联：依照式(Ⅰ)所示多肽结构式的氨基酸序列，将D型氨基酸经HBTU/HOBT、DIEA活化后加入树脂，从C端至N端进行顺序反应得到含多肽的树脂；
[0013]多肽的切除和沉淀：将所述含多肽的树脂置于切割液中2～3h，经冰乙醚沉淀，50％乙腈水重悬，0.45μM滤膜过滤，得到多肽粗品；所述切割液以1mL去离子水计，包含1mL去离子水、17.6mL TFA、0.4mL Tips和0.7g苯酚；
[0014]多肽的分离纯化：将所述冻干的粗品多肽溶于6M盐酸胍水溶液中，使用制备反相C18液相色谱(HPLC)分离所述多肽粗品，收集主要峰产物。
[0015]具体地，在本专利技术提供的一种手性止血多肽的制备方法中，其包括：
[0016](1)以Rink Amide MBHA树脂为固相载体，称取树脂倒入反应器内，加入10mL DMF浸泡溶胀，上下翻转30min，抽干液体，用DMF，DCM交替洗涤二次，最后用DMF洗涤2次，每次30s。
[0017](2)用含20％哌啶的DMF洗脱Fmoc 2次，分别为5min，10min。2次洗脱中间用DMF洗涤1次，洗涤30s，之后依次用DMF，DCM交替洗涤二次，最后用DMF洗涤2次，每次30s。将DMF溶解的第一个D型氨基酸经HBTU/HOBT、DIEA活化30s后，混合到树脂中，室温上下翻转反应30min。抽滤，用DMF，DCM交替洗涤二次，最后用DMF洗涤2次，每次30s。重复上一流程。按照式(Ⅰ)所示多肽结构式的氨基酸序列顺序从C端至N端依次反应即可得到含手性止血多肽的树脂。
[0018](3)将反应完的树脂用甲醇和DCM依次洗涤4次，干燥树脂，将树脂转移到耐酸碱的20mL玻璃瓶中，瓶中含有17.6mL三氟乙酸,0.4mL Tips、1mL去离子水，0.7g苯酚的切割液，置于磁力搅拌器下，室温下搅拌反应2～3h，转速为550rpm。反应完成后，将切割液缓慢倒入装有冰乙醚的50mL离心管中，析出白色沉淀，离心弃上清(4度，4000rpm，3min)，乙醚洗涤3次。最后用50％乙腈水重悬，0.45μM滤膜过滤，液体收集在50mL离心管中，液氮速冻，获得多肽粗品。
[0019](4)将冻干的多肽粗品溶于6M盐酸胍水溶液中，0.22μM滤膜过滤，使用制备反相C18液相色谱(HPLC)分离粗产物。收集主要峰产物进行电喷雾质谱鉴定，其中液相流速0.1mL/min，流动相为50％CAN(含千分之一甲酸)，在冷冻干燥机上冷冻干燥，得到所述手性止血多肽，多肽样品
‑
20℃保存。
[0020]另一方面，本专利技术涉及一种凝胶，其包括手性止血多肽和钙离子溶液。
[0021]进一步地，在本专利技术提供的一种凝胶中，每100L的1g/L钙离子溶液与0.5～10g所
述手性止血多肽混合。
[0022]本专利技术对多肽进行修饰和改造，以D型氨基酸为原料，制备得到一种手性止血多肽，其为钙离子结合肽，在钙离子的作用下，多肽序列自组装为纳米线，兼顾了稳定性与功效性。由本专利技术提供的由一种手性止血多肽制备的凝胶经试验证明其展现出良好的止血及生物相容性，体内应用不引起局部及全身炎症反应，且机体内降解时间短，已到达促进止血以及伤口愈合和骨再生的功效。由此，本专利技术进一步请求保护由本专利技术提供的手性止血多肽制备的凝胶在制备止血材料中的应用和在制备促进骨再生材料中的应用。基于上述应用，本专利技术进一步请求保护基于本专利技术在无创造性活动下可得到的一种止血材料、一种止血组合物和一种促进骨再生的组合物。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果或优点：
[0024]本专利技术提供的由手性止血多肽制备的凝胶经试验证明其展现出良好的止血及生物相容性，体内应用不引起局部及全身炎症反应，且机体内降解时间短，兼具促进止血、伤口本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种手性止血多肽，其特征在于，所述一种手性止血多肽结构式如式(Ⅰ)所示：2.一种手性止血多肽的制备方法，其特征在于，包括：树脂的活化：DMF浸泡溶胀树脂30min，去除液体后，采用DMF和DCM交替洗涤2次，然后用DMF洗涤2次，每次洗涤时间为30s。；氨基酸的耦联：依照式(Ⅰ)所示多肽结构式的氨基酸序列，将D型氨基酸经HBTU/HOBT、DIEA活化后加入树脂，从C端至N端进行顺序反应得到含多肽的树脂；多肽的切除和沉淀：将所述含多肽的树脂置于切割液中2～3h，经冰乙醚沉淀，50％乙腈水重悬，0.45μM滤膜过滤，得到多肽粗品；所述切割液以1mL去离子水计，包含1mL去离子水、17.6mL TFA、0.4mL Ti...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文佳，何旺骁，闫瑾，
申请(专利权)人：陕西未来多肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：